ВРОЖДЕННЫE МИАСТЕНИЧЕСКИЕ СИНДРОМЫ: ПРОГРЕСС ЗА ПОСЛЕДНЕЕ ДЕСЯТИЛЕТИЕ

Сongenital Myastenic Syndromes: Progress over the past decade

Andrew G. Engel, Kinji Ohno, and Steven M. Sine

Muscle & Nerve, 2003, vol. 27, рр. 4-25

Correspondence to: A.G.Engel; e-mail: age@mayo.edu

За последнее десятилетие произошел быстрый прогресс в диагностике врожденных миастенических синдромов (ВМС), в раскрытии их патогенеза на молекулярном уровне и в использовании систем экспрессии млекопитающих для расшифровки того, как найденные мутации белков, связанных с концевой пластиной, дезорганизуют нейромышечную трансмиссию. Изучение всех идентифицированных ВМС сопровождалось тщательными клиническими исследованиями. Клинические наблюдения часто сопровождались работами in vitro: электрофизиологическим анализом нейромышечной трансмиссии, patch-clamp записями токов (потоков) через единственный канал ацетилхолиновых рецепторов (AchR) и детальными исследованиями ультраструктуры и цитохимии концевой пластины. Во многих случаях предшествующие исследования указывали на генных или белковых кандидатов. Например, кинетическая аномалия AchR, обнаруженная на уровне единственного канала, предсказывала кинетические мутации субъединицы AchR; дефицит AchR на концевой пластине предполагал наличие мутаций в субъединицах AchR или рапсине; отсутствие ацетихолинэстеразы (AchЕ) на концевой пластине говорило о мутациях каталитической субъединицы или субъединицы коллагенового хвоста AchЕ; а наличие в анамнезе кратких эпизодов удушья, связанных с зависящим от стимуляции понижением потенциалов и тока на концевой пластине, вовлекало белки, участвующие в ре-синтезе ацетилхолина (Ach) или наполнении везикул. Исследование экспрессии сразу за мутационным анализом не только предоставило доказательство патогенности, но и обеспечило подход к рациональной терапии, привело к точным структурно-функциональным корреляциям и высветило функционально значимые молекулярные домены, которых не смогли обнаружить предыдущие систематические исследования мутагенеза. В настоящем обзоре анализируется прогресс в исследовании ВМС за последнее десятилетие и обсуждаем клинические и базовые научные аспекты индивидуальных нарушений.

ДИАГНОСТИКА ВРОЖДЕННОГО МИАСТЕНИЧЕСКОГО СИНДРОМА

Генетическая диагностика ВМС часто бывает возможна на основе миастенических симптомов, проявляющихся с самого рождения или раннего детства, типичной картины гипотонии мышц лицевого скелета и высокого арковидного нëба, наличия в анамнезе больных родственников с теми же симптомами, угасающего электромиографического (ЭМГ) ответа потенциала сложного мышечного действия на повторную низкочастотную стимуляцию (2-3 Гц) двигательного нерва, а также негативных тестов на AchR и антитела кальциевого канала. Некоторые ВМС являются спорадическими или выявляющимися позже, угасающий ЭМГ ответ может присутствовать не во всех мышцах и не всегда, и проявления слабости могут быть ограничены, не распространяясь на мышцы черепа. Для диагностики некоторых ВМС достаточно простых гистологических и ЭМГ исследований, а для точной специфической диагностики других необходимы электрофизиологические,

структурно-функциональные и иммунохимические исследования in vitro (Таблица 1)

* - не все исследования необходимо проводить для всех ВМС

КЛАССИФИКАЦИЯ ВРОЖДЕННЫХ МИАСТЕНИЧЕСКИХ СИНДРОМОВ

Обычно определяемые ВМС возникают из дефектов пресинаптической и синаптической базальной пластины и постсинаптических белков, и существует несколько различных пресинаптических и постсинаптических ВМС. Таблица 2 показывает классификацию на основе первичного патологического дефекта (147 семейных случаев ВМС). Эта классификация полезна, но является предварительной, т.к. вполне могут быть обнаружены дополнительные типы ВМС. Кроме того, при не полностью исследованных нарушениях, таких как ВМС пояса конечностей ⁸⁶ и ВМС, связанных с недоразвитием лицевого скелета у иранских евреев ¹²⁷, локализация дефектов не была определена. Исключая медленно-канальный синдром, который вызывается доминантными мутациями с функциональным улучшением, все остальные ВМС вызваны рецессивными мутациями.

Таблица 2. Классификация ВМС на основе локализации дефектов *

*- классификация основана на когорте больных ВМС, исследованных в

клинике Mэйo между 1988 и 2002 годом

** - генетические дефекты идентифицированы

ПРЕ-СИНАПТИЧЕСКИЕ ВРОЖДЕННЫЕ МИАСТЕНИЧЕСКИЕ СИНДРОМЫ

К настоящему времени описано 4 пресинаптических ВМС:

(1) ВМС, связанные с эпизодическим апноэ (ВМС-ЭА), причиной которых были дефекты холин-ацетилтрансферазы (ChAT) ¹¹⁴;

(2) ВМС с недостаточностью синаптических везикул и уменьшенным выделением “квантов” ¹⁴³;

(3) ВМС, напоминающий синдром Lambert-Eaton^{10, 45}; и

(4) ВМС с уменьшенным выделением “квантов”, вызванным неизвестным механизмом ⁸⁴.

ВРОЖДЕННЫЙ МИАСТЕНИЧЕСКИЙ СИНДРОМ С ЭПИЗОДИЧЕСКИМ АПНОЭ.

Клинические особенности этого заболевания были впервые описаны в 1960 г. Greer and Schotland ⁵⁹, а в 1975 г. Conomy et al. ²⁵ назвали его «семейной младенческой миастенией». Но поскольку все ВМС могут быть семейными и возникают чаще всего в младенчестве, этот термин стал неспецифическим и источником недоумений ³⁷. Поскольку клинические особенности представляют собой неожиданные и внезапные эпизоды тяжелой одышки и бульбарной слабости с кульминацией в апноэ, мы называем его ВМС с эпизодическим апноэ (ВМС-ЭА). Недавние работы по исследованию ВМС-ЭА не выявили дефицита AchЕ или AchR на концевой пластине, но заподозрили поврежденный ресинтез или наполнение везикул Ach ^{40, 96}.

Клинические особенности. У некоторых пациентов при рождении возникает гипотония и тяжелая бульбарная и респираторная слабость, требующие поддержки младенца искусственной вентиляцией легких. Постепенно это состояние улучшается, но позднее возникают атаки апноэ и бульбарные паралич, ускоряемые инфекцией, лихорадкой или возбуждением, или возникающие без видимой причины. Между этими эпизодами у больных могут наблюдаться умеренно тяжелые или слабые симптомы заболевания, или же не наблюдаться вовсе. У других больных, бывших в норме при рождении, развиваются атаки апноэ в период младенчества или детства ⁴⁵. У некоторых детей после острых эпизодов апноэ наблюдается длительная респираторная недостаточность, иногда неделями. Фенотипическая гетерогенность может наблюдаться даже внутри данной родственной группы. Например, в одной родственной группе два сибса внезапно умерли в возрасте 2 и 11 месяцев во время атаки лихорадки; у одного не было симптомов заболевания, а у другого – слабые проявления птоза перед смертью. У третьего сибса начались острые приступы одышки и цианоза, нараставшие под влиянием лихорадки или вакцинации, или без видимой причины в возрасте 14 месяцев; в возрасте 32 месяцев у больного развился птоз и аномальная утомляемость при напряжении, что позволило диагностировать миастеническое расстройство ²¹.

В электрофизиологических клинических исследованиях ослабевающий ответ на 2Гц-стимуляцию и аномалии при одноволоконной ЭМГ определялись только в случае слабости тестируемых мышц. Слабость и ослабевающий ответ на 2Гц-стимуляцию можно вызвать в некоторых (но не всех) мышцах либо упражнениями, либо 10Гц-стимуляцией в течение 5-10 мин ^{40, 61, 65, 96, 126}. Это, однако, не специфично для ВМС-ЭА, т.к. может также возникнуть у некоторых больных ВМС с дефицитом AchЕ или AchR на концевой пластине.

Исследование концевой пластины. Число AchR на одну пластину, определяемое числом сайтов, присоединяющих ¹²⁵I--бунгаротоксин, и постсинаптическая ультраструктура находятся в норме, но морфометрический анализ показывает, что в отдыхающей мышце синаптические везикулы меньше нормальных ⁹⁶. Экспериментальные микроэлектродные исследования образцов межреберной мышцы in vitro обнаружили, что амплитуда миниатюрного потенциала на концевой пластине нормальна в отдыхающей мышце, но аномально уменьшается после 5-минутной 10Гц-стимуляции. Амплитуда потенциала на концевой пластине также аномально уменьшается в процессе 10Гц-стимуляции, а затем медленно восстанавливается в течение последующих 10-15 мин (Рис. 1А), но квантовое содержание потенциала концевой пластины остается неизменным ^{21, 96}. Аномальное уменьшение амплитуды во время 10Гц-стимуляции может наблюдаться и при других ВМС, но при этих ВМС она возвращается к базовому уровню менее чем за 2 мин.

Молекулярные исследования. То, что синаптический ответ аномально ослабляется, когда поток импульсов по нейронам возрастает, а затем медленно восстанавливается, указывает на дефект в ре-синтезе или наполнении везикул Ach и предполагает 4 генных кандидата: пресинаптический транспортер холина с высокой степенью сродства (высокоафинный) ^{8, 118}, AchТ ¹⁰⁰, транспортер везикулярного холина (ТВAch=VachT) ⁴⁶ и везикулярный протоновый насос ¹²⁵ (Рис.2). Анализ мутаций у 5 больных ВМС-ЭА не обнаружил мутаций ТВAch=VachT, но выявил 10 рецессивных мутаций ChAT ¹¹⁴ (Рис.1В). Одна мутация была незначительной; 3 другие (I305T, R420C и E441K) значительно уменьшали экспрессию ChAT в COS клетках. Кинетические исследования 9 очищенных мутантов с изменением смысла, экспрессия которых была вызвана бактериями, показали, что у одного из них (E441K) отсутствовала каталитическая активность, а у 8 других (L210P, P211A, I305T, R420C, R482G, S498L,V506L и R560H) она была значительно нарушена (см. Рис. 1С).

То, что ни у одного больного ВМС-ЭА не наблюдалось симптомов в центральной или автономной нервной системе, предполагает, что нейромышечный синапс избирательно уязвим в отношении мутаций ChAT. Нет свидетельств того, что эта избирательная уязвимость объясняется наличием специфичных к тканям изоформ ChAT. Хотя у людей существует 5 альтернативных транскриптов ChAT с, по крайней мере, тремя различными стимуляторами (промотерами)³⁹, наблюдаемые нами мутации находятся на общем кодирующем участке узнаваемых изоформ ChAT. Правдоподобным объяснением избирательного нейромышечного вовлечения являются различия в пресинаптических уровнях ChAT, холина или ацетил-СоА; скоростях поглощения холина или скоростях высвобождения Ach в условиях усиленного нейронного потока импульсов.

В заключение, очень важно заметить, что дефекты, обнаруживаемые в пресинаптическом транспортере холина с высокой степенью сродства ^{8, 118}, транспортере везикулярного холина (VAchT) ⁴⁶ или везикулярном протоновом насосе ¹²⁵, могут иметь одинаковые фенотипические последовательности, но у человека до настоящего времени не обнаружено мутаций в этих белках.

Лечение. Препараты ацетилхолинэстеразы улучшают состояние больных с миастенической симптоматикой между респираторными кризами, а также предотвращают или смягчают кризы. По этой причине, профилактическое лечение ацетилхолинэстеразой показано даже больным, асимптоматичным между кризами. Во время респираторных кризов больного следует лечить парентеральными дозами неостигмин-метил-сульфата или пиридостигмин-бромида. Каждый больной также должен иметь при себе спасательную надувную сумку и подогнанную маску для использования во время криза и в период доставки в больницу. Каждому больному с подозрением на ВМС-ЭА необходим длительный мониторинг ночных апноэ ²¹.

НЕДОСТАТОК СИНАПТИЧЕСКИХ ВЕЗИКУЛ И УМЕНЬШЕНИЕ ВЫДЕЛЕНИЯ “КВАНТОВ”.

До настоящего времени был описан только один случай подобного расстройства. Эти больные имели такие же электромиографические и клинические показатели, как и больные аутоиммунной миастенией gravis, но были и отличия. Болезнь у первых выявлялась с рождения, отсутствовали анти-AchR антитела, не было дефицита AchR на концевой пластине и электронная микроскопия не выявила постсинаптических аномалий. На пресинаптический дефект указывало уменьшение числа квантов Ach (m), высвобождаемых при нервном импульсе, до 20% нормы. Уменьшение величины m было связано с уменьшением числа квантов, готовых к выделению (n), что, в свою очередь, было связано с уменьшением численной плотности симпатических пузырьков до 20% от нормального уровня на не стимулированных нервных окончаниях ¹⁴⁸. Симптоматику больного улучшали пиридостигмином.

При этом нарушении последовательность клинических событий развивалась из-за недостатка синаптических пузырьков на нервных окончаниях. Предшественники синаптических везикул, связанные с различным набором протеинов в везикулах, продуцируются в перикарионе клетки переднего рога и транспортируются вдоль двигательного аксона к нервным окончаниям с помощью движителя, подобного кинезину ^{15, 73, 78, 117}. Зрелые везикулы, содержащие полный комплект везикулярных протеинов, собираются в нервных окончаниях ¹¹⁷ и затем наполняются Ach. После выделения Ach с помощью экзоцитоза, везикулярные мембраны повторяют цикл и снова наполняются Ach ¹⁴⁰. При этом синдроме уменьшение плотности синаптических пузырьков может возникать по причине: (1) нарушения в образовании предшественников синаптических везикул в клетке переднего рога; (2) нарушения в транспорте одного или более видов предшественников везикул вдоль аксона; (3) нарушений в сборе зрелых синаптических пузырьков из их предшественников или (4) нарушений в повторении цикла синаптических везикул на нервных окончаниях. Тот факт, что плотность синаптических везикул уменьшается даже в не

стимулированных нервных окончаниях, свидетельствует об отсутствии нарушений в повторении везикулярного цикла.

ВРОЖДЕННЫЙ МИАСТЕНИЧЕСКИЙ СИНДРОМ, НАПОМИНАЮЩИЙ МИАСТЕНИЧЕСКИЙ СИНДРОМ ЛАМБЕРТА-ИТОНА (Lambert-Eaton syndrome).

У одного ребенка с этим синдромом (работа 1987 г.) амплитуда потенциала сложного мышечного действия (ПСМД) была аномально малой, но в несколько раз возросла при тетанической стимуляции, и симптоматика была улучшена гуанидином ¹⁰. Другой такой больной – 6-месячная девочка с тяжелой бульбарной слабостью и слабостью конечностей, гипотонией, арефлексией и респираторной зависимостью с рождения. ЭМГ показала низкую амплитуду ПСМД, которая возрастала на 500% при высокочастотной стимуляции и убывала на 40% при низкочастотной стимуляции. Исследования образца локтевой мышцы выявили отсутствие дефицита AchR на концевой пластине. Электронная микроскопия концевых пластин выявила структурно интактные пресинаптические и постсинаптические участки и большое количество синаптических везикул на нервных окончаниях. Миниатюрный потенциал на концевой пластине (МПКП) был нормальным для размера мышечного волокна. Квантовое содержание потенциала концевой пластины (ПКП), m, было менее 10% от нормы при 1-Гц-стимуляции, а 40-Гц-стимуляция увеличила m на 300%. Так, полученные ин витро электрофизиологические данные очень напоминали миастенический синдром Ламберта-Итона ⁷⁶. В соответствии с этим, аномалии ЭМГ были улучшены лечением 3,4-диаминопиридином (3,4-ДАП) – агентом, увеличивающим число квантов Ach, выделяемых при нервном импульсе ⁷⁹, но больная осталась слабой и респираторно-зависимой. Молекулярный базис этой ВМС может быть связан с аномалией пресинаптического калиевого канала со стробированным напряжением (voltage-gated calcium channel) или компонентом комплекса высвобождения синаптических везикул. Мутационный анализ гена, кодирующего поро-образующую ₁-субъединицу Са 2,1, или кальциевый канал P/Q типа, экспрессированного на пресинаптической мембране, не выявил никаких мутаций (Ohno and Engel, 1999, неопубликованные данные).

Другие пресинаптические врожденные миастенические синдромы с

уменьшенным выделением квантов при нервном импульсе.

Недавно Maselli et al. ⁸⁴ опубликовали данные о 3 спорадических больных с миастеническими симптомами (2 – с младенчества, 1 – после 5 лет), не задевшими наружные глазные мышцы. У всех троих были другие неврологические симптомы, включавшие атаксию туловища или конечностей и, в одном случае, горизонтальный нистагм. В отличие от больных с синдромом Ламберта-Итона, ни у одного из них не было аномально низкого впервые вызванного ПСМД, и уменьшенный ответ на 2Гц-стимуляцию увеличивался при высокочастотной стимуляции. Не было дефицита AchR на концевой пластине. Электронная микроскопия обнаружила нервные окончания нормального размера с нормальным числом синаптических везикул, показала маленькие саккулы, обрамленные двойной мембраной и наполненные пузырьками. Исследования in vitro с использованием микроэлектродов показали значительное уменьшение числа квантов Ach (m), высвобождаемых при 1Гц-стимуляции. У одного больного это было связано со значительно уменьшенной вероятностью выделения квантов (p); у другого больного наблюдалось <50%, но все же значительное уменьшение величины n. Поиск мутаций выбранных экзонов гена, кодирующего поро-образующую ₁-субъединицу кальциевого канала P/Q типа, не дал результата. Один из 3 больных хорошо реагировал на комбинированное лечение с помощью пиридостигмина и 3,4-ДАП, у одного наблюдалось лишь слабое улучшение под влиянием комбинированной терапии пиридостигмином и эфедрином, а у одного больного отсутствовала адекватная реакция на пиридостигмин.

ВРОЖДЕННЫЕ МИАСТЕНИЧЕСКИЕ СИНДРОМЫ, СВЯЗАННЫЕ С СИНАПТИЧЕСКОЙ БАЗАЛЬНОЙ ПЛАСТИНОЙ

Дефицит ацетилхолинэстеразы на концевой пластине.

Этот тип ВМС развивается из-за отсутствия AchЕ в синаптическом пространстве ^{41, 67, 105}. Ацетилхолинэстераза является ферментом, отвечающим за быстрый гидролиз Ach, выделенной в процессе холинэргического синапса. На нормальной концевой пластине AchЕ ограничивает число коллизий между Ach и AchR и, следовательно, продолжительность синаптического ответа ⁷¹. Ингибирование энзима приводит к увеличению продолжительности взаимодействия Ach и AchR и действия потенциала на концевой пластине (ПКП), к десенсибилизации AchR ⁷² и блока деполяризации при физиологических мощностях стимуляции ⁸⁵, и к миопатии концевой пластины с потерей AchR, из-за перегрузки катионов постсинаптической области ^{35, 128}.

Клинические особенности. У большинства пациентов болезнь проявляется в неонатальном периоде, полностью лишая их сил; у других она проявляется в детстве, делая их инвалидами только на втором десятке жизни ³⁸ или позже ¹³⁰. Клинические обследования дали следующие диагнозы: (1) ослабевающий (пониженный) ЭМГ ответ; (2) повторные потенциалы сложного мышечного дейсвия (ПСМД), имеющие меньшую амплитуду и снижающиеся быстрее, чем первый ПСМД; (3) отсутствие влияния ингибиторов AchЕ концевой пластины на снижающийся ответ или клиническое состояние больного; и (4) слабая реакция на свет зрачка некоторых ⁶⁷ (но не всех ¹³⁰) больных. Диагноз подтверждается демонстрацией отсутствия AchЕ на концевой пластине или патогенных мутаций в гене, кодирующем субъединицу коллагенового хвоста AchЕ концевой пластины.

Исследование концевой пластины. Отсутствие AchЕ на концевых пластинах было определено на основании гистохимических, иммунохимических и электронно-цитохимических критериев. Электронная микроскопия концевых пластин (КП) выявила аномально маленькие нервные окончания, нередко частично или полностью изолированные от постсинаптической области клетками Шванна (Schwann cеlls), распространяющимися в синаптическую щель (расщелину). Малый размер нервных окончаний и их охват клетками Шванна ограничивает число квантов, которые могут быть выделены нервным импульсом (n), но имеет тенденцию к смягчению постсинаптического поражения, возникающего из-за чрезмерной стимуляции не гидролизованной Ach. Не смотря на этот защитный механизм, многие КП демонстрируют очаговую дегенерацию складок соустья с потерей AchR, и дегенерирующие органеллы, везикулы и апоптотические ядра находят приют в саркоплазме соустья ^{41, 67}.

Молекулярный патогенез. Тип AchЕ концевых пластин – это гетеромерный асимметрический энзим, состоящий из одного, двух или трех гомотетрамеров Т изоформы глобулярных каталитических субъединиц (AchЕ₁), присоединенных к втрое скрученному коллагеновому хвосту (ColQ). Субъединица коллагенового хвоста имеет на N-конце домен, присоединенный в богатой пролином области (PRAD), коллагеновый центральный домен и С-конец, обогащенный заряженными остатками, и цистеинами (Рис. 3А). Каждый виток ColQ может присоединить AchЕ₁-тетрамер к своему PRAD, давая в результате типы А₄, А₈ и А₁₂ асимметрической AchЕ ¹⁴. Две группы заряженных остатков коллагенового домена (домены, присоединяющие гепаран-сульфат-протеогликан, или HSPBD) плюс другие остатки в области С-конца ^{74, 105} указывают, что асимметрический энзим вошел в синаптическую базальную пластину. Область С-конца также должна участвовать в инициации сборки ColQ в виде тройной спирали, которая осуществляется от С-конца в направлении N-конца на манер замка-молнии ¹²¹.

В 1998 г. была клонирована ДНК, комплементарная человеческому COLQ (гену, кодирующему ColQ) (кДНК) ^{38, 104}, определена геномная структура COLQ ¹⁰⁴, и молекулярная основа дефицита AchЕ на концевой пластине прослежена до рецессивных мутаций гена COLQ ^{38, 104}. К настоящему времени идентифицировано 24 мутации этого гена в 25 семейных группах ^{38, 68, 103-105, 130} (Рис. 3В). Три основных вида мутаций следующие: (1) мутации PRAD прекращают присоединение AchЕ₁ к ColQ; (2) мутации в области коллагенового домена производят короткий, скрученный в виде единичной спирали ColQ, присоединяющий единственный тетрамер AchЕ₁ и не способный войти в синаптическую базальную пластину.; и (3) мутации на С-конце либо мешают сборке коллагенового домена в виде тройной спирали, либо производят асимметрические типы AchЕ, либо и то и другое.

Лечение. В настоящее время нет удовлетворительной лекарственной терапии дефицита AchЕ на концевых пластинах. Анти-эстераз (анти-AchЕ) следует избегать, поскольку она неэффективны, а больные с дефицитом AchЕ имеют усиленную чувствительность к их побочному токсическому действию. Если нет подозрения на дефицит AchЕ, резистентность к анти-AchЕ может подвигнуть врача к увеличению дозы лекарства; но это, в свою очередь, может вызвать избыточную бронхиальную секрецию и ухудшить клиническое состояние больного.

ПОСТСИНАПТИЧЕСКИЕ ВРОЖДЕННЫЕ МИАСТЕНИЧЕСКИЕ СИНДРОМЫ

Обзор структуры AchR.

Большинство постсинаптических ВМС развиваются в результате дефицита или кинетической аномалии AchR. Поэтому мы начнем с краткого обзора структуры мышечного подтипа AchR. Мышечный AchR – это неотъемлемый мембранный протеин, состоящий из 5 гомологических субъединиц: две , по одной  и , одна  в AchR взрослых или одна , вместо , в зародышевом AchR. Гены, кодирующие ,  и , находятся в разных локусах на 2q хромосоме, а гены, кодирующие  и  - в разных локусах на 17р хромосоме. Субъединицы высоко гомологичны, имеют одинаковую вторичную структуру, одинаковые складки и организованы как бочарная клёпка вокруг центрального катион-отбирающего канала. Каждая субъединица имеет N-концевой внеклеточный домен, который составляет ~ 50% первичной последовательности, 4 трансмембранных домена (TMD1- TMD4), большой цитоплазматический домен между доменами TMD3 и TMD4, и маленький С-концевой внеклеточный домен.

Два сайта, присоединяющие Ach, образованы в интерфейсах между субъединицами - и - в зародышевой и денервированной мышце, и - и - мышц взрослых. Остатки как , так и не- субъединиц вносят значительный вклад в присоединение Ach и конкурирующих антагонистов, что свидетельствует о том, что места присоединения Ach находятся в интефейсах между субъединицами ^{27, 70, 120}. Мутагенез, вместе с лигандами, выбирающими между двумя сайтами, выявили 7 отдельных линейных петель внутри каждой  и не- субъединицы, названные петлями A-G, соответственно каждому сайту. В исследованиях сайтов, с использованием меченых атомов, все 7 петель, кроме одной, были физически локализованы в присоединяющем сайте, что послужило дальнейшей демонстрацией наличия множества петель ^{23, 32, 51, 144}. Недавнее рентгеновское исследование структуры змеиного нервноклеточного протеина, присоединяющего Ach, подтвердили, что остатки всех 7 петель присутствуют на сайте, присоединяющем лиганд, в том числе Y93 в петле A, W149 в петле B, Y190 и Y198 в петле C, W55 в петле E, L119 и P121 в петле F, и D175 в петле G. Все эти остатки хорошо сохраняются и могут представлять минимальные структуры, необходимые для присоединения Ach. Дополнительные остатки на периферии сайта были идентифицированы с помощью мутагенеза и подтверждены методом определения присоединяющего Ach протеина нервных клеток змеи ¹⁷. К ним относятся G153 в петле B, S187, V188 и T189 в петле C, K34 в петле D, D59 в петле E, L109, Y111, S115 и N117 в петле F и E177 в петле G. Эти периферические остатки могут составить структуры, специализированные для присоединения Ach в концентрациях, найденных в моторном синапсе, или для высвобождения связанного Ach со скоростью, достаточной для завершения ответа.

Miyazawa et al ⁹⁴ недавно решили проблему плотности электронов в двухмерных кристаллах Torpedo AchR до разрешения в 4.6 Å. На уровне мембраны плотность электронов выявляет 5 стержней (rods) (телец, палочек), типичных для -спиралей, которые закручиваются при активации и обеспечивают поток проникающих ионов ¹⁴². Эти rods соответствуют домену TMD2, с возможным вкладом от домена TMD1, что основано на мутагенезе с доступной заменой цистеина и функциональных исследованиях. Коллективные исследования показывают, что внеклеточная часть каждого TMD2 образует -спираль, 3 срединных (средних) остатка формируют вытянутую структуру, а оставшийся – это -спираль, за которой идет -нить (стрэнд, стренга, прядь), которая образует «заслонку» в канале и избирательный ионный фильтр около цитоплазматической границы домена TMD2 ^{4, 26, 70}. Плотности электронов, соответствующие TMD3 и TMD4, не были определены, но длинный цитоплазматический домен между ними, похоже, вносит вклад в создание структуры, наподобие корзины с отверстиями, распространяющейся внутрь цитоплазмы ⁹⁴, которая служит местом прикрепления цитоскелетных элементов, несет остатки, которые могут быть фосфорилированы, и, таким образом, может играть важную роль в процессе сенсибилизации, а в случае -субъединицы, стабилизирует механизм образования «заслонки» ⁹¹.

Мутации при ВМС были найдены во всех субъединицах AchR и в нескольких доменах субъединиц, в том числе главном внеклеточном домене, который вносит вклад в сайт присоединения Ach, доменах TMD1- TMD4 и длинном цитоплазматическом домене между TMD3 и TMD4. Не смотря на такое различие мишеней, мутации при ВМС можно подразделить на 2 больших категории: те мутации, которые усиливают ответ на Ach при медленно-канальных синдромах, и те, которые уменьшают ответ при быстро-канальных синдромах или вследствие низко-экспрессивных мутаций. Медленно- и быстро-канальные мутации возникают из кинетических мутаций с изменением смысла и физиологически противоположны. Таблица 3 показывает аналогичные черты обоих синдромов. Прежде чем обсуждать ВМС, вызванные медленно- и быстро-канальными мутациями, мы представляем фундаментальные кинетические принципы активации рецепторов с помощью Ach.

* - при индивидуальныз медленно- и быстро-канальных синдромах действуют различные комбинации механизмов. Сокращения:  - скорость открытия канала,  - скорость закрытия канала.

** - КП – концевая пластина.

Обзор кинетики AchR

Поскольку медленно- и быстро-канальные мутации могут возникнуть в результате мутаций либо в трансмембранных доменах, либо в сайтах присоединения лиганда к AchR, для объяснения последовательностей данных мутаций важна механистическая схема, в противоположность структурной, как, например, Схема 1, где А – агонист, R – состояние покоя, а R* - состояние с открытым каналом. Присущими Схеме 1 являются стабильные основные состояния, распространенными формами которых являются R, AR, A₂R и A₂R*, представляющие глубокие колодцы в энергетической картине рецептора. Константы скорости для каждого шага обеспечивают измерение высоты энергетического барьера, или активированного комплекса, между стабильными основными состояниями. Более того, Схема 1 отвечает за совместный эффект взаимоотношения доза-Ach-ответ и зависимости времени открытого и закрытого состояния одного канала от концентрации Ach. Таким образом, Схема 1 отвечает за существенные особенности активации для AchR разных видов ^{138, 148}. Схема 1 является сокращенным вариантом MWC (Monod-Wyman-Changeux) аллостерического описания белковой функции (Схема 2). Эта схема содержит состояние покоя (R) и активное состояние (R*), которые переходят одно в другое даже в отсутствие агониста и наводят на мысль, что агонист сильнее привязывается к активному состоянию, чем к состоянию покоя (константы равновесной диссоциации К* гораздо меньше, чем К). Если дано, что Ach присоединяется более крепко к активному состоянию, константа равновесия Ǿ между состояниями покоя и активности прогрессивно увеличивается с увеличением количества присоединенного агониста, так что Ǿ₀ < Ǿ₁ < Ǿ₂; для мышечного AchR Ǿ₀ ~ 10^-6, Ǿ₁ ~ 10^-2, а Ǿ₂ ~ 30. Таким образом, агонист преодолевает неблагоприятную константу Ǿ₀, благодаря более тесному присоединению к активному состоянию, чем к состоянию покоя ⁶⁹.

МЕДЛЕННО – КАНАЛЬЦЕВЫЕ СИНДРОМЫ

Клинические особенности

Медленно-канальные (М-К) синдромы вызываются доминантными мутациями с приобретением функции (gain-of-function mutation). Некоторые

М-К ВМС развиваются на ранних этапах жизни и вызывают тяжелую неработоспособность к концу первых десяти лет ⁹⁰; другие возникают позже и медленно прогрессируют, развивая небольшую неработоспособность даже на шестом-седьмом десятке жизни ^{42, 45, 139}. У большинства больных наблюдается поражение шейных мышц и разгибателей пальцев и запястья. У большинства больных, кроме наиболее тяжелых, мышцы черепа чаще остаются не задетыми. Прогрессирующее нарушение формы позвоночника и затрудненное дыхание являются обычными осложнениями эволюционирующей болезни. Пролонгированные эпизоды открытия канала AchR приводят к более длительным току и потенциалам на концевой пластине (Рис. 4В и 4С), которые, в свою очередь, вызывают один или более повторных потенциалов сложного мышечного действия (ПСМД). Повторная стимуляция вызывает ослабление ответа, который присутствует при низкочастотной стимуляции и прогрессивно увеличивается при увеличении ее частоты. Повторные ПСМД (СМАРs) имеют меньшую амплитуду и ослабевают быстрее, чем первый ПСМД.

Исследование концевой пластины

Морфологические следствия возникают из-за длительных эпизодов активации канала AchR, вызывающих катионную перегрузку в постсинаптической области. Избыточную аккумуляцию Са⁺⁺ можно увидеть на некоторых концевых пластинах с помощью окрашивания ализарином красным, который определяет милимолярные концентрации Са⁺⁺ (Рис. 5А и 5В). Развивающаяся миопатия концевой пластины похожа на миопатию при дефиците AchЕ на концевой пластине, но гораздо тяжелее, вызывая иногда массивную деструкцию складок синапса (Рис. 5С), апоптоз ядер и дегенерацию вакуолей около концевых пластин ^{42, 44, 45, 90}.

Микроэлектродные исследования in vitro демонстрируют значительное пролонгирование потенциалов на концевых пластинах (ПКП= ЕРР) и токов, которые убывают би-экспоненциально ^{44, 109, 139}. Одноканальные patch-clamp записи обнаруживают каналы двух видов на AchR, одни с нормальными, а другие с пролонгированными эпизодами открытия, отражая как рецепторы «дикого типа», так и рецепторы-мутанты ^{44, 90, 109}. Кроме того, каналы рецепторов-мутантов открываются даже в отсутствие Ach ^{90, 109}, что приводит к возникновению «течи» через катионы в постсинаптическую область. Безопасности границы нейромышечной трансмиссии угрожает изменение геометрии концевой пластины, потеря AchR из дегенерирующих складок синапса и блок деполяризации в процессе физиологической активности, благодаря лестничному суммированию сильно пролонгированных ПКП.

Молекулярные исследования

К настоящему времени опубликованы сообщения о 15 М-К мутациях с приобретением функций ^{28, 44, 55-57, 90, 109,110, 116, 139,145}. В различных субъединицах AchR и в различных функциональных доменах этих субъединиц возникают разные мутации. Клинические последствия варьируют. В общем, болезнь прогрессирует из-за структурных повреждений концевой пластины, но мутации в TMD-доменах имеют более тяжелые клинические последствия, чем мутации внеклеточных доменов. Рatch-clamp исследования концевой пластины, анализ мутаций и экспрессии в эмбриональных клетках почек человека показывают, что мутация G153S рядом с внеклеточным сайтом присоединения Ach ¹³⁹ (см. также ниже) и мутация N217К в N-концевой части TMD1 ¹⁴⁵, в основном, усиливают сродство к Ach. Это замедляет диссоциацию Ach с места его присоединения и способствует повторному открытию канала во время оккупации рецептора агонистом, что продлевает эпизод активации. Мутации S226Y и S226F в TMD1 усиливают как сродство, так и эффективность заслона в канале ¹¹⁶. Мутации в TMD2, которые выстилают (покрывают) пору (пористость) канала, такие как V266M, L269F, T264P и V249F, а также S269I во внеклеточном соединителе TMD2/TMD3 действуют, главным образом, как усилители эффективности работы заслонки канала (gaiting = скорость открытия канала  / скорость закрытия канала ) ^{44, 60, 90, 109}. Изменчивое увеличение стабильного состояния сродства к Ach и сопутствующее увеличение степени десенсибилизации наблюдаются также с мутантами V249F ⁹⁰, L269F ⁴⁴ и T264P ¹⁰⁹. Есть публикация, что М-К мутация в TMD2 -субъединицы (S268F) влияет, в основном, на работу заслонки (gaiting) ⁵⁷.

Были также сообщения о других М-К мутациях, таких как V156М около сайта присоединения Ach ²⁸, S268F ⁵⁶, L262M ⁵⁵, T254I ²⁸ и V265A ¹¹⁰ – в TMD2, и V229F – TMD1 ⁵⁶, но без детального анализа их действия на кинетику активации рецептора.

Лечение. Хинидин является долго живущим блокатором открытия канала AchR ¹³⁷, и его клинически достижимая концентрация нормализует длительные эпизоды открытия канала, вызываемые М-К мутантами, экспрессия которых происходит на эмбриональных почечных клетках (ЭПК) человека ⁵⁰ (Рис. 6). На основании этих данных, Harper and Engel ⁶² проводили лечение М-К больных хинидин-сульфатом (по 200 мг 3-4 раза в день), что давало уровень в сыворотке крови 0.7-2.5 г/мл (2.1-7.7 моль/л). Состояние больных постепенно улучшалось по клиническим и ЭМГ показателям. Другой долго живущий блокатор открытия канала AchR, флюоксетин (fluoxetine), тоже терапевтически эффективен, но для проявления эффекта необходима относительно высокая доза приема (80 мг/день для взрослых).

Механистические следствия медленно-канальных ВМС.

Большинство М-К ВМС развиваются из-за мутаций в TMD2. Наиболее заметный эффект мутаций в TMD2 – это драматическое увеличение открытий канала, индуцированных Ach: от ~ 0.5 мсек для AchR дикого типа и вплоть до 50 мсек при мутациях в TMD2 ^{44, 90, 109}. Заметны также частые открытия канала AchR, в отсутствие Ach ^{44, 90}, которые изредка наблюдаются у AchR дикого типа. Полная установка констант скорости активации на Схеме 1 не была найдена для рецепторов с мутациями в TMD2, в связи с неспособностью распределить множественные компоненты времени закрытости канала по отдельным кинетическим шагам (этапам) ⁹⁰.

Увеличение спонтанного открытия канала, связанного с мутациями в TMD2, указывает на возрастание величины Ǿ₀, которая описывает равновесие между состояниями отдыха и активности, в отсутствие Ach. Малая величина Ǿ₀ совершенно необходима для минимизации притока катионов в состоянии покоя и для максимизации ответа на Ach. Увеличение спонтанных открытий канала, в связи с мутациями в TMD2, может объяснить, почему соответствующие М-К синдромы являются более тяжелыми, чем синдромы, связанные мутациями в сайте присоединения лиганда. Независимое от Ach равновесие между состояниями отдыха и активности является стартовой точкой для того, чтобы рисовать схему MWC (Схему 2). Первый шаг присоединения Ach, таким образом, начинается с момента, когда мутантный рецептор уже подстегнут к открытию, и усиленное сродство к Ach в состоянии активности, по сравнению с состоянием покоя, содействует дальнейшему открытию рецептора с одним присоединенным лигандом, согласно уравнению Ǿ₁ = Ǿ₀ К₁/К₁*. Аналогично этому, увеличение Ǿ₁ приводит к присоединению 2 лигандов к AchR, провоцируя увеличение соответствующей константы открытия канала Ǿ₂, в соответствии с уравнением Ǿ₂ = Ǿ₁ К₂/ К₂*. Скорости открытия канала тоже возрастают, причем наиболее очевидно – скорость открытия в отсутствие Ach (₀)_. Скорость открытия с 2 лигандами (₂) также возрастает, в связи с мутациями в TMD2 ⁹⁰, хотя степень возрастания неясна, поскольку скорость открытия для AchR дикого типа приближается к точке, ограничивающей разрешающую способность метода patch-clamp. Скорость закрытия при присоединении 2 лигандов (₂) замедляется при мутации в TMD2, в связи со стабилизацией открытого состояния канала, относительно переходного состояния между открытием и закрытием. Таким образом, благодаря мутации в TMD2, активация канала усиливается через транзиторное взаимодействие с Ach, действующим в данном синапсе. Поскольку доказано, что TMD2 формирует ионный канал, функциональные последствия мутации в этом домене являются, по-видимому, результатом пертурбаций с механизмом работы «заслонки» канала. Хотя аппарат «заслонки» включает TMD всех 5 субъединиц, действующих синхронно, TMD2 мутации одной субъединицы не зависят, по-видимому, от мутаций TMD2 других субъединиц ⁷⁵. Суммарный результат мутаций в TMD2 показывает, что его структура существенна для стабилизации канала в состоянии покоя и закрытия, относительно состояния открытия и десенсибилизации; стабильность закрытого состояния предотвращает нежелательный поток катионов при состоянии покоя, пока происходит оптимизация фракции способных к активации рецепторов. Результаты далее показывают, что структура TMD2 настроена для установления стабильности открытого состояния относительно транзиторного.

Медленно-канальные ВМС возникают также от мутаций в сайте присоединения лиганда. Мутация G153S была первой, обнаруженной в сайте присоединения Ach, и была локализована в одной из 3 ключевых петель в -субъединице, имеющей отношение к сайту ¹³⁹. Будучи расположенной с фланга ароматических остатков W149 и Y151 ³³, G153S сильно замедляет скорость диссоциации Ach с AchR, который находится в закрытом состоянии с 2 присоединенными лигандами, увеличивая сродство Ach к этому неактивному состоянию. В мутантном AchR закрытое состояние с 2 лигандами повторно открывается при единичной Ach оккупации, поскольку скорость открытия канала  примерно в 46 раз больше, чем скорость диссоциации Ach k _–2 , в то время как  только в 3.5 раза больше, чем k _–2 в AchR дикого типа. Мутация G153S стабилизирует как состояние открытого канала, так и состояние десенсибилизации, что предполагает возрастание сродства Ach к этим функциональным состояниям. Увеличение стабильности открытого состояния предполагается на основании замедления скорости закрытия канала , в то время как увеличение стабильности состояния десенсибилизации демонстрируется более тесным соединением Ach с рецептором, десенсибилизированным, благодаря местному применению анестетика проадифена (proadifen). Таким образом, G153S усиливает сродство Ach к состояниям покоя, активности и десенсибилизации AchR.

Увеличение повторных открытий канала под влиянием G153S дает прямое подтверждение давней теории о том, что уменьшение потока катионов на концевой пластине зависит не только от констант скорости работы механизма «заслонки» канала, но и от способности агониста связываться с рецептором ²⁴. Таким образом, замедляя скорость диссоциации Ach k _–2 (Схема 1), G153S пролонгирует индивидуальные эпизоды активации, известные как «взрыв, вспышка, всплеск», согласно уравнению _В = ₀ (1+/ k _–2), где _В – это средняя продолжительность вспышки, а ₀ – средняя продолжительность интервала открытия канала. Продолжительность вспышки увеличивается далее, вследствие более медленной скорости закрытия канала (), которая увеличивает среднюю продолжительность открытия, согласно выражению ₀ = 1/. Вероятность того, что рецептор с 2 лигандми откроется, увеличивается, согласно уравнению Р = /(+ k _–2), предвещая увеличение пика ответа вслед за мгновенным высвобождением Ach. Десенсибилизация усиливается мутацией G153S, в связи с его более крепкой привязкой к этому рефрактерному состоянию. Таким образом, увеличивая время нахождения Ach в сайте присоединения к AchR во всех состояниях последнего, G153S вызывает больший пик ответа, увеличивает продолжительность «вспышки» и усиливает десенсибилизацию.

БЫСТРО – КАНАЛЬЦЕВЫЕ СИНДРОМЫ.

Быстро-канальные (Б-К) мутации наблюдались в ,  и  субъединицах AchR (Рис. 7А). Мутации во внеклеточных доменах субъединиц уменьшают сродство к Ach, мутации в TMD доменах уменьшают эффективность механизма «заслонки», а мутации в длинных цитоплазматических петлях -субъединицы дестабилизируют кинетику каналов.

Клинические особенности напоминают таковые аутоиммунной миастении gravis, но симптомы мягкие, если пострадал только механизм «заслонки» каналов ¹⁴⁶, умеренно-тяжелые, если кинетика каналов нестабильна ^91,147, и тяжелые, если ослаблено сродство к Ach или же нарушено как сродство к Ach, так и эффективность работы заслонки ^{20, 115, 132, 133}. Мутация Е59К во внеклеточном домене -субъединицы, уменьшающая сродство к Ach, особенно интересна, т.к. является причиной врожденных контрактур суставов из-за недостаточной подвижности в utero зародыша ²⁰.

Исследование концевых пластин. В Б-К синдромах с низким сродством, вызванных мутацией Р121L во внеклеточном домене -субъединицы, морфология концевой пластины и экспрессия AchR находятся в норме ^{115, 133}. В ВМС с ослабленной эффективностью механизма заслонки, вызванной мутацией V285I в TMD3-доменах -субъединицы ¹⁴⁶, а также в ВМС с нестабильной кинетикой каналов, вызванной внедрением 18 пар оснований (1254ins18) в длинную цитоплазматическую петлю -субъединицы ⁹¹, экспрессия AchR также уменьшена. В этих ВМС множество малых участков концевой пластины разбросаны над протяженной поверхностью волокон, некоторые пост-синаптические участки упрощены, и экспрессия AchR на складках синапса (места соединения, соустья) обрывочна и ослаблена. Однако структурная целостность постсинаптического региона сохраняется.

К обычным электрофизиологическим особенностям Б-К ВМС относятся аномально краткие эпизоды активации каналов (Рис. 7В) и быстро убывающий низко-амплитудный ток на концевой пластине (Рис. 7С). Уменьшение амплитуды синаптического ответа связано с уменьшением вероятности открытия канала и, в случае мутаций 1254ins18 и V285I, с уменьшением экспрессии мутантного рецептора.

Молекулярные исследования. Было идентифицировано 8 Б-К мутаций ^{20, 91, 115, 131-133, 146, 147} (Рис. 7А). В большинстве случаев аллель-мутант, вызывающий кинетические аномалии, сопровождается ничтожной мутацией во втором аллеле, так что кинетические мутации доминируют над клиническим фенотипом, но гомозиготные Б-К мутации также присутствуют.

Лечение. Б-К синдромы обычно хорошо реагируют на комбинированную терапию 3.4-диаминопиридином (3,4-DAP), увеличивающим величину m и количество ингибиторов холинэстеразы, которые способствуют росту числа рецепторов, активированных каждым квантом. Больные с нормальной плотностью AchR на синаптических складках реагируют лучше других, т.к. уменьшение плотности рецепторов на складках влечет за собой пропорциональное снижение числа рецепторов, которые могут быть насыщены любым данным квантом.

Кинетические следствия быстро-канальных мутаций

Б-К мутации во внеклеточном домене или TMD3.

При Б-К ВМС, возникающих из-за мутаций в главном внеклеточном домене (Р121L) или в TMD3 (V285I), наиболее заметные эффекты – это драматическое уменьшение как частоты, так и продолжительности вспышек открытия канала, индуцированных Ach ^{115, 146}. Скорость открытия ₂ дважды оккупированного рецептора замедляется в 500 раз, и средняя продолжительность вспышки открытия канала уменьшается с ~ 3 мсек для AchR дикого типа до 1 мсек для Б-К мутантов. Уменьшение активности канала сопровождается уменьшением стабильности сродства к Ach.

Уменьшение частоты и продолжительности вспышек открытия канала возникает в результате замедления ₂ одновременно со скоростью диссоциации

Ach (k _–2), т.к. вероятность того, что дважды оккупированный рецептор откроется, описывается выражением ₂ / (₂ + k _–2). Большая величина ₂ также важна для быстрого открытия канала после мгновенного высвобождения Ach, а большая величина k _–2 обеспечивает быстрое завершение ответа, что существенно для высокочастотной стимуляции мышцы. При Б-К ВМС, развивающихся из-за мутации Р121L, замедление ₂ в 500 раз могло быть результатом более тесной связи Ach с состоянием покоя, но сродство к Ach в состоянии покоя подверглось лишь слабому воздействию. Таким образом, Р121L выступает как критическая мутация для формирования переходного состояния на пути к открытому состоянию.

Для эффективного открытия канала существенно более тесная связь Ach с открытым состоянием канала, которое нарушается при Б-К ВМС под влиянием мутации Р121L на сайте присоединения Ach. Сродство для открытого состояния определяли детальной балансировкой, используя измеренное сродство для закрытого состояния и уравнение работы «заслонки» для единожды и дважды оккупированных рецепторов, выводимые в следующем цикле из Схемы 2 (см. Схему 3 на стр. 16). Сродство при открытом состоянии, описываемое выражением К₂* = К₂ Ǿ₁ / Ǿ₂ , уменьшалось с 35 нмоль для дикого типа до 1.5 моль для Р121L ¹¹⁵. Таким образом, Р121L препятствует сродству Ach к сайту присоединения в открытом состоянии, что смещает равновесие открытого состояния в сторону состояния покоя. Данные этих исследований показывают, что более тесная связь Ach с открытым состоянием является фундаментальной движущей силой, лежащей в основе активации AchR, индуцированной агонистом.

Быстро-канальные ВМС, вызванные мутациями в длинном цитоплазматическом домене между TMD3 и TMD4.

С момента начального клонирования субъединиц AchR длинный цитоплазматический домен между TMD3 и TMD4 привлекал особое внимание. Анализ (по методу Фурье) гидрофобности остатков как функции последовательности выдвинул строгое предположение о наличии у цитоплазматического домена амфипатической вторичной структуры в виде -спирали ⁴⁷. Более поздний анализ вторичной структуры, на основе выравнивания (регулирования) множества последовательностей, позволил разделить цитоплазматический домен на 3 предсказанные -спирали, обозначенные буквами F, G и H, соответственно остаткам -субъединицы 320-333, 398-415 и 421-435 ⁷⁷. Амфипатическая композиция изначально предполагала образование ионного канала, но мутагенез показал, что цитоплазматический домен можно удалить без потери активности канала ⁹². Сведения о функциональной значимости цитоплазматического домена получены из исследований структурной основы кинетического сдвига в организме человека, от зародыша до взрослого, когда средняя продолжительность открытия канала уменьшалась от 10 мсек до 1 мсек и AchR, содержащие -субъединицу, замещаются AchR, содержащими -субъединицу. Было показано, что многие остатки - и -субъединиц на 50% ответственны за кинетический сдвиг, причем равновесие было обеспечено 2 остатками соседнего домена TMD4 ¹⁶. Суммарный результат показал, что -субъединица играет специфическую роль в сдвиге кинетики AchR у взрослых, причем функционально значимые остатки находятся в спиралях G и H цитоплазматического домена. Две мутации ВМС показали, что цитоплазматический домен играет важную роль в управлении кинетикой активации AchR. Первый случай возник из-за тандемной дупликации 6 остатков, STRDQE (1254ins18), начинающейся в кодоне 413-418 спирали G ⁹¹, а второй – из-за мутации А411Р, как раз на 2 остатка выше названной дупликации ¹⁴⁷.

Функциональные последствия дупликации 6 остатков STRDQE в -субъединице. STRDQE-дупликация (1254ins18)⁹¹ вызывает внезапное изменение кинетики каналов отдельных рецепторов, известное также как mode-switching. Оно редко наблюдается в AchR дикого типа ^{9, 97, 147}, но тот факт, что оно происходит, предполагает, что STRDQE-мутация усиливает нормальный процесс. Такие кинетические сдвиги часто наблюдались в течение эпизодов активации под влиянием высоких концентраций Ach, выступая как кластеры событий с быстрой преемственностью, граничащие с длительными периодами неподвижности. Внутри кластеров можно различить 3 отдельных кинетических сдвига, и каждый из них имеет уменьшенную вероятность открытия, связанную с более низкой скоростью открытия канала и более высокой скоростью его закрытия. Кинетический анализ отдельных кинетических сдвигов выявил 2 открытых состояния при насыщающих концентрациях Ach, в отличие от единичных открытых состояний, наблюдаемых в AchR дикого типа. Таким образом, исследование STRDQE-дупликаци дало первый намек на то, что цитоплазматическая пется управляет единообразием кинетики «заслонки» AchR.

Функциональные последствия мутации А411Р. В отличие от STRDQE-дупликаци, начинающейся в кодоне 413 -субъединицы, соседняя мутация А411Р не увеличивает частоту кинетических сдвигов внутри кластеров, а вызывает, вместо этого, индивидуальные кластеры эпизодов активации, способствуя расширению кинетического спектра ¹⁴⁷. Импульсы тока через наиболее индивидуальные рецепторы-мутанты оказались кинетически одинаковыми, но каждый эпизод активации имел уникальную кинетическую сигнатуру с расширенным спектром вероятности открытия. Моделирующий анализ по методу Hidden Markov показал, что распределение Гаусса для всех констант скорости свойственно кинетике активации индивидуальных рецепторов (Схема 1). Распределение констант скорости присоединения агониста не изменяется под влиянием мутаций, но распределения констант скорости для стадий открытия и закрытия канала обнаружили колебания в широких пределах. Мутации пролина, локализованного по бокам А411Р, тоже показали широкий спектр кинетики, подобный спектру, который дает А411Р, в то время как пролиновые мутации, находящиеся в эквивалентной позиции на - и -субъединицах, показали обычный узкий диапазон кинетических характеристик, свойственных AchR дикого типа ¹⁴⁷. Возможность того, что А411Р вызывает гетерогенность складчатости индивидуальных рецепторов, была признана маловероятной, т.к. индивидуальные рецепторы проявляют кинетический сдвиг между mode-switching-событиями (вызываемыми STRDQE-дупликациями), отличаясь малым числом эпизодов активации. Таким образом, -субъединица выступает как структура, управляющая кинетикой «заслонки» каналов, где остатки по бокам А411Р поддерживают правильность констант открытия и закрытия канала.

Механистические следствия мутаций в длинной цитоплазматической петле -субъединицы. Анализ мутации А411Р дает унифицирующее объяснение кинетических последствий структурных изменений в цитоплазматической петле, в том числе кинетических сдвигов у зародышей и взрослых, mode-switching под влиянием STRDQE-дупликации и широкого спектра кинетических изменений под влиянием А411Р. Каждый из этих эффектов может быть приписан к локализованному структурному изменению в цитоплазматическом домене, которые влияют на глобальную энергетику, управляющую «заслонкой» канала. Наблюдение того факта, что как AchR дикого типа, так и AchR-мутанты колеблются, по типу челнока, между многочисленными стабильными состояниями, говорит о том, что энергетическая картина, лежащая в основе заслонки каналов AchR, имеет складчатую структуру ⁴⁸. Поскольку в AchR дикого типа заслонка работает преимущественно по одному пути, складчатость накладывается на отвесное основание в форме воронки. Рецепторы, содержащие мутацию А411Р, подвергаются воздействию такой же складчатой энергетической картины, но складчатость накладывается на гораздо менее глубокую воронку основания. Таким образом, локальный регион, расположенный по бокам А411Р, формирует широкое основание, на которое накладывается складчатость. В мутации А411Р барьеры, отделяющие энергетические колодцы, относительно высоки, такие же, как в AchR дикого типа, так что лишь редкие кинетические сдвиги определяются во время индивидуальных эпизодов активации. Так, кроме воздействия на абсолютные скорости работы заслонки, цитоплазматическая петля -субъединицы контролирует точность констант скорости работы «заслонок» каналов. Все полученные данные позволяют предположить, что примордиальный (первичный) рецептор открывается и закрывается в широком кинетическом диапазоне, но что эволюция вводит и тонко настраивает новые структуры, такие как цитоплазматическая петля, чтобы создать рецептор сегодняшнего дня, в котором заслонка работает по однородной кинетике.

Дефицит AchR, вызванный мутацией генов субъединиц AchR.

Клинические симптомы варьируют от мягких до очень тяжелых. В общем, больные, испытывающие низко-экспрессивные или даже гомозиготные незначительные (null) мутации в -субъединице, могут иметь мягкую симптоматику. Наоборот, больные с низко-экспрессивными мутациями в не--субъединице имеют тяжелую симптоматику, и к настоящему времени не наблюдали еще ни одного больного с незначительными мутациями в обоих аллелях не--субъединицы.

Исследование концевой пластины. Морфологические исследования показали, что поверх увеличенной массы мышечного волокна распределено увеличенное число участков с концевыми пластинами. Целостность соединительных складок (мест соединения) сохраняется, но некоторые участки концевых пластин упрощены и меньше нормальных. Распределение AchR на соединительных складках носит пятнистый характер и плотность реакций с AchR уменьшена. Иммуноцитохимическая реакция с участием рапсина, молекулы, связывающейся перекрестно с молекулами AchR, уменьшена пропорционально уменьшению экспрессии AchR.

Квантовый ответ на концевой пластине, определяемый амплитудой миниатюрного потенциала и тока на концевой пластине, уменьшен, но квантовый ответ нервного импульса часто выше, чем в норме. У больных с низко-экспрессивными или незначительными мутациями в -субъединице одноканальные patch-clamp измерения (записи, данные) ^{88, 111} и иммуноцитохимические исследования ⁴³ выявили присутствие зародышевого

-AchR на концевой пластине.

Молекулярные исследования. ВМС с тяжелым дефицитом AchR на концевой пластине являются результатом различных типов гомозиготных или, более часто, гетерозиготных рецессивных мутаций генов субъединиц AchR. Мутации сконцентрированы в -субъединице. Возможная причина этого состоит в том, что постоянная экспрессия -субъединицы, хотя и в небольшом количестве, может компенсировать отсутствие -субъединицы ^{31, 43, 91, 111}, в то время как больные с незначительными мутациями в не-, а других субъединицах могут не выжить при отсутствии заменяющей субъединицы. Кроме того, ген, кодирующий -субъединицу, и особенно экзоны, кодирующие длинную цитоплазматическую петлю, имеют высокое содержание GС, которое может предрасполагать к реконструкциям (перестройкам, перегруппировкам) ДНК.

Дефицит AchR возникает в результате мутаций, которые вызывают преждевременную терминацию трансляционной цепи, в результате сдвига рамки, нахождения в сплайс-сайте или непосредственной генерации стоп-кодона; точечных мутаций в районе стимуляции (промотерном регионе); хромосомной микроделеции; и мутаций с изменением смысла. Некоторые мутации с изменением смысла возникают в сигнальном пептидном участке (G-8R ¹¹⁵ и V-13D ⁸⁷). Другие мутации с изменением смысла охватывают остатки, важные для сборки пентамерного (пятичленного) рецептора; мутации этого типа наблюдались в -субъединице в сайте N-гликозилирования (S143L) ¹¹⁵, в цистеине 128 (C128S) ⁹¹, аргинине 147 (R147L) внеклеточного домена, лежащем между изолейцином 145 и треонином 150, которые являются остатками, участвующими в сборке субъединиц ¹¹¹, и в треонине 51 (T51P) ⁸⁷; а также одновременно с делецией 3 кодонов в длинной цитоплазматической петле -субъединицы ¹²². Другие мутации с изменением смысла влияют как на экспрессию AchR , так и на кинетику. Например, R311W на длинной цитоплазматической петле, между М3 и М4, уменьшает ¹¹¹, а P245L в М1 увеличивает ¹¹¹ продолжительность открытия канала. В случае с R311W и P245L, кинетические последствия скромные и, похоже, перекрываются (затемняются) уменьшением экспрессии мутантного гена.

Таким образом, надо заметить, что мутация сдвига рамки 1267delG, возникающая при гомозиготности, является эндемической для цыганских семейств или семейств юго-восточно-европейского происхождения ^{1, 29, 102}, причем исходит она от цыган.

Лечение. Большинство больных умеренно хорошо реагируют на анти-холинэстеразные препараты, а некоторые демонстрируют дополнительный успех при приеме 3,4-DAP ⁶³.

ДЕФИЦИТ AchR, ВЫЗВАННЫЙ МУТАЦИЕЙ РАПСИНА.

Дефицит AchR на концевой пластине может возникнуть из-за дефекта протеинов, регулирующих экспрессию или концентрацию AchR на концевой пластине. Эти протеины включают агрин ^{52, 98} и его сигнальные молекулы, специфичную для мышц киназу (MuSK)⁵⁴ и рапсин AchR^{6, 53, 124}, нейрегулин и его сигнальные молекулы ^{5, 129, 134}, а также -дистробревин ⁹⁸, атрофин ⁵⁸ и -синтрофин ³. Однако было показано, что только мутации рапсина вызывают связанный с ВМС дефицит AchR на концевой пластине.

Рапсин, под влиянием неврального агрина, играет критическую роль в концентрации AchR на постсинаптической мембране двигательной концевой пластины ⁴⁹.

Рапсин присоединяется к длинной цитоплазматической петле каждой субъединицы AchR ^{80, 81} и соединяет рецептор с субсинаптическим скелетом через дистрогликан ²² и синаптический фиксирующий протеин (S-NRAP) ¹⁴¹, родственный небулину и присоединяющий актин. Первичная структура рапсина предопределяет разные структурные домены: myristoylation сигнал на N-конце, требуемый для мембранной ассоциации ¹²⁴; семь повторов тетратрико-пептида (TPRs: кодоны 6-279), который помогает самоассоциации рапсина ^{123, 124}; домен в виде витой катушки (coiled-coil) (кодоны 298-331), гидрофобная поверхность которых может присоединяться к детерминантам внутри длинной цитоплазматической петли каждой субъединицы AchR ^{12, 123}; домен RING-H2, богатый цистеином (кодоны 363-402), который соединяется с S-NRAP ¹⁴¹ и цитоплазматическим доменом -дистрогликана ¹³ ; и сайт на кодоне 406, где происходит фосфорилирование серина.

Само-ассоциация рапсина является критическим фактором для присоединения AchR к цитоскелету. Рапсин, экспрессия которого происходит на ЭПК человека или других не мышечных клетках, самоассоциируется в кластеры на поверхности клеток. Когда AchR, -дистрогликан и S-NRAP экспрессированы индивидуально на ЭПК человека, ни один из этих белков не агрегируется в кластеры, но если либо AchR ^{49, 119, 123}, дистрогликан ^{7, 13} либо S-NRAP ¹⁴¹ экспрессированы вместе с рапсином, каждый белок вовлекается в кластеры, образованные рапсином.

Клинические особенности. У больных с мутациями в рапсине, возникает мягкая или тяжелая симптоматика. Более того, у 2 больных, гомозиготных в отношении той же самой N88K мутации рапсина, возникли разные симптомы: тяжелые симптомы у 2-летнего ребенка и мягкие у 27-летнего больного. Наконец, один больной, страдающий с рождения множественными контрактурами суставов, в возрасте 11 лет имел слабо выраженную болезнь ¹⁰⁷. Ослабевающий электромиографический ответ был получен у двух тяжело больных, но у двух легко больных дефект нейромышечной трансмиссии был выявлен только после физической нагрузки или с помощью одно-волоконной электромиографии.

Исследование концевой пластины.

Морфологические и электрофизиологические данные, полученные при исследовании ин витро концевой пластины, подобны данным, наблюдавшимся у больных, у которых дефицит AchR на концевой пластине возникает из-за низко-экспрессивной мутации в генах субъединиц AchR. Экспрессия как рапсина, так и AchR уменьшаются, так же как у больных с первичным дефицитом AchR, поэтому нет различий в локализации дефектов AchR и рапсина на концевой пластине.

Молекулярные исследования. При исследовании ВМС мы выделили 37 больных с дефицитом AchR, но без кинетических аномалий. Поиск мутаций в генах субъединиц AchR. , ,  и  выявил патогенные мутации у 27 из этих больных. Чтобы выявить причину дефицита AchR у остальных 10 больных, мы исследовали последовательность гена рапсина и у 4 больных нашли мутантные аллели, возникшие из 3 мутаций ¹⁰⁷ (Рис. 9). Исследования экспрессии рапсина мутантного и дикого типа, одновременно с субъединицами AchR дикого типа в ЭПК человека, показали, что ни одна из мутаций не ухудшала само-ассоциацию рапсина, но каждая мутация уменьшала вовлечение AchR в кластеры рапсина.

Лечение. Все исследованные до настоящего дня больные неплохо реагировали на анти-холинэстеразные препараты, а некоторые больные получили дополнительное облегчение при приеме 3,4-DAP.

ВРОЖДЕННЫЕ МИАСТЕНИЧЕСКИЕ СИНДРОМЫ,

АССОЦИИРОВАННЫЕ С ДЕФИЦИТОМ ПЛЕКТИНА.

Плектин – это высоко сохранный и повсеместно экспрессированный промежуточный протеин, связывающийся с филаментами (тонкими волокнами) и концентрирующийся в местах механического стресса, таких как постсинаптическая мембрана концевой пластины, сарколемма, Z-диски в скелетной мышце, гемидесмосомы в коже и диски с прослойками в сердечной мышце. Патогенные мутации плектина ассоциированы с симплексными вариациями буллезного эпидермолиза, прогрессирующей миопатией и миастеническим синдромом (обзор Banwell et al.¹¹).

Подробное исследование одной больной симплексом буллезного эпидермолиза показал, что экспрессия плектина отсутствовала в мышце, была сильно уменьшена в коже и была связана с прогрессирующей миопатией; наблюдалась аномальная утомляемость, в том числе мускулатуры глаз, лица и конечностей, и пониженный ЭМГ ответ, а также отсутствие антител к AchR. Морфологические исследования мышцы продемонстрировали некротические и регенерирующие волокна и широкий спектр ультраструктурных аномалий. Многие концевые пластины имели аномальные конфигурации с цепями малых участков по поверхности волокон, и несколько концевых пластин имели очаги дегенерации соединительных складок. Содержание AchR на концевых пластинах было в норме. Электрофизиологические исследования in vitro обнаружили нормальное высвобождение квантов нервным импульсом, малую величину миниатюрного потенциала на концевой пластине и экспрессию как зародышевого, так и взрослого AchR на концевых пластинах. Пиридостигмин не улучшал симптоматику больной, но 3,4-DAP увеличивал ее силы и выносливость ¹¹.

REFERENCES

1. Abicht A, Stucka R, Karcagi V, Hercegfalvi A, Horvath R, Mortier W, Schara U, Ramaekers V, Jost W, Brunner J, Janssen G, Seidel U, Schlotter B, Pongratz D, Rudel R, Lochmuller H. A common mutation (el267delG) in congen­ital myasthenic patients of Gipsy ethnic origin. Neurology 1999,53:1564-1569.

2. Abicht A, Stucka R, Song I-H, Karcagi V, Kugler K, Baum-garten-Walczak A, Stier c, Pongratz D, Mortier W, Miiller-Ferber W, Lochmuller H. Genetic analysis of the entire AChR t-subunit gene in 52 congenital myasthenic families. Acta Myol 2000;19:23-27.

3. Adams ME, Kramarcy M, Krall SP, Rossi SG, Rotundo RL, Sealock R, Froehner SC. Absence of a-syntrophin leads to structurally aberrant neuromuscular synapses deficient in utrophin. J Cell Biol 2000; 150:1385-1398.

4. Akabas MH, Kaufmann C, Archdeacon P, Karlin A. Identifi­cation of acetylcholine receptor channel-lining residues in the entire M2 segment of the alpha subunit. Neuron 1994; 13:919-927.

5. Altiok N, Altiok K, ChangeuxJ-P. Heregulin-stimulated ace­tylcholine receptor gene expression in muscle—require­ment for MAP kinase and evidence for parallel inhibitory pathway independent electrical activity. EMBO J 1997; 16:717-725.

6. Apel ED, Glass DJ, Moscosco LM,Yancopoulos GD, SanesJR. Rapsyn is required for MuSK signaling and recruits synaptic components to a MuSK-containing scaffold. Neuron 1997;18:623-625.

7. Apel ED, Roberds SL, Campbell KP, Merlie JP. Rapsyn may function as a link between the acetylcholine receptor and the agrin-binding dystrophin-associated glycoprotein com­plex. Neuron 1995;15:115-126.

8. Apparsundaram S, Ferguson SM, George ALJr, Blakely RD. Molecular cloning of a human, hemicholinium-3-sensitive choline transporter. Biochem Biophys Res Comrnun 2000;276:862-867.

9. Auerbach A, Lingle CJ. Heterogeneous kinetic properties of acetylcholine receptor channels in Xenopus oocytes. J Physiol (Lond) 1986:378:119-140.

10. Bady B, Chauplannaz G, Carrier H. Congenital Lambert-Eaton myasthenic syndrome. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1987:50:476-478.

11. Banwell BL, Russel J, Fukudome T, Shen X-M, Stilling G, Engel AG. Myopathy, myasthenic syndrome, and epidermol-ysis bullosa simplex due to plectin deficiency. J Neuropathol Exp Neurol 1999:58:832-846.

12. Bartoli M, CohenJB. Identification of the modular domains of rapsyn binding to nicotinic acetylcholine receptor (AChR) and to dystroglycan. Soc Neurosci Abstract 2001;27:Program No. 904.16.

13. Bartoli M, Ramarao MK, Cohen JB. Interacdons of the rapsyn RING-H2 domain with dystroglycan. J Biol Chem 2001;276:24911-24917.

14. Bon S, Coussen F, Massoulie J. Quaternary associations of acetylcholinesterase. II. The polyproline attachment domain of the collagen tail. J Biol Chem 1997;272:3016-3021.

15. Booj S, Larsson P-A, Dahllof A-G, Dahlstrom A. Axonal transport of synapsin I and cholinergic synapdc vesicle-like material. Further immunohistochemical evidence for trans­port ofaxonal cholinergic transmitter vesicles in motor neu­rons. Acta Physiol Scand 1986;128:155-165.

16. Bouzat C, Bren N, Sine SM. Structural basis of different gadng kinedcs of fetal and adult acetylcholine receptors. Neuron 1994,13:1395-1402.

17. Brejc K, van Dijk WV, Schuurmans M, van der OostJ, Smit AB, Sixma TK. Crystal structure of ACh-binding protein reveals the ligand-binding domain of nicodnic receptors. Nature 2001;411:269-276.

18. Brengman JM, Ohno K, Milone M, Friedman RL, Feldman RG, Engel AG. Identificadon and funcdonal characteriza­tion of eight novel acetylcholine receptor mutations in six congenital myasthenic syndrome kinships. Neurology 2000;54(Suppl3):A182-A183.

19. Brengman JM, Ohno K, Shen X-M, Engel AG. Congenital myasthenic syndrome due to two novel mutadons in the acetylcholine receptor e subunit gene. Muscle Nerve 1998;21(Suppl7):S120.

20. Brownlow S, Webster R, Croxen R. Brydson M, Neville B, Lin J-P, Vincent A, Newsom-Davis J, Beeson D. Acetylcholine receptor S subunit mutations underlie a fast-channel myas­thenic syndrome and arthrogryposis muldplex congenita. J Clin Invest 2001;108:125-130.

21. Byring RF, Pihko H, Shen X-M, Gustafsson B, Hackman P, Ohno K, Engel AG, Udd B. Congenital myasdienic syn­drome associated with episodic apnea and sudden infant death. Neuromuscul Disord 2002;12:548-553.

22. Cartaud A, Coutant S, Petmcci TC, CartaudJ. Evidence for in situ and in vitro association between p-dystroglycan and the subsynaptic 43K rapsyn protein. Consequence for acetyl­choline receptor clustering at the synapse. J Biol Chem 1998;273:11321-11326.

23. Chiara DC, Middleton RE, CohenJB. Identification ofu-yp-tophan 55 as the primary site of PHJnicodne photoincor-poration in the gamma subunit of Torpedo nicotinic acetyl­choline receptor. FEBS Lett 1998;423:223-226.

24. Colquhoun D, Sakmann B. Fluctuations in the microsecond time range of the current through single acetylcholine re­ceptor ion channels. Nature 1981;294:464.

25. ConomyJP, Levisohn M, FanaroffA. Familial infantile my-asdienia gravis: a cause of sudden deadi in young children. J Pediair 1975;87:428-429.

26. CorringerJP, Bertrand S, GalziJ-L, Devillers-Thiery A, Chan-geux J-P, Bertrand D. Mutational analysis of the charge selecdvity filter of the a7 nicotinic acetylcholine receptor. Neuron 1999;22:831-843.

27. Corringer JP, Le Novere N, Changeux J-P. Nicotine recep­tors at the amino acid level. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2000;40:431-458.

28. Croxen R, Newland C, Beeson D, Oosterhuis H, Chauplanaz G, Vincent A, Newsom-Davis J. Mutadons in different func­tional domains of the human muscle acetylcholine receptor a subunit in padents with die slow-channel congenital my­asthenic syndrome. Hum Mol Genet 1997:6:767-774.

29. Croxen R, Newland C, Betty M, Vincent A, Newsom-Davis J, Beeson D. Novel funcdonal t-subunit polypepdde generated by a single nucleotide deledon in acetylcholine receptor deficiency congenital myasthenic syndrome. Ann Neurol 1999-46:639-647.

30. Croxen R, Newsom-Davis J, Beeson D. Endplate acetylcho-line receptor deficiency syndrome: two new mutations. Acta Myol 2000; 19:45-48.

31. Croxen R, Young C, Slater C, Haslam S, Brydson M, Vincent A, Beeson D. Endplate y- and e-subunit mRNA levels in AChR deficiency syndrome due to e subunit null mutations. Brain 2001;124:1362-1372.

32. Czajkowski C, Karlin A. Structure of the nicotinic receptor acetylcholine binding site.J Biol Chem 1995;270:3160-3164.

33. Dennis M, GiraudatJ, Kotzyba-Hilbert F, Goeldner M, Hirth C, ChangJ, Lazure C, Cretien M, ChangeuxJ-P. Amino acids of Torpedo marmorata acetylcholine receptor alpha subunit labeled by a photoaffinity ligand for the acetylcholine bind­ing site. Biochemistry 1988;27:2346-2357.

34. Deprez PN, Inestrosa NC. Two heparin-binding domains are present on the collagenic tail of asymmetric acetylcholines-terase.J Biol Chem 1995;270:11043-11046.

35. Dettbam WD. Pesticide induced muscle necrosis: mecha­nism and prevention. Fund Appi Toxicol 1984;4:S18-S26.

36. Deymeer F, Serdaroglu P, Gulsen-Parman Y, Oznirk A, 6z-demir C. Clinical characteristics of a group of Turkish pa­tients having a benign CMS phenotype with ptosis and marked ophthalmoparesis and mutations in the acetylcho­line receptor epsilon subunit gene. Acta Myol 2000;19:29-32.

37. Deymeer F, Serdaroglu P, Ozdemir C. Familial infantile myasthenia: confusion in terminology. Neuromuscul Disord 1999:9:129-130.

38. Donger C, Krejci E, Serradell P, Eymard B, Bon S, Nicole S, Chateau D, Gary F, Fardeau M, Massoulie J, Guicheney P. Mutation in the human acetylcholinesterase-associated gene, COLQ, is responsible for congenital myasthenic syndrome with end-plate acetylcholinesterase deficiency. Am J Hum Genet 1998;63:967-975.

39. Eiden LE. The cholinergic gene locus. J Neurochem 1998;70:2227-2240.

40. Engel AG, Lambert EH. Congenital myasthenic syndromes. Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppi 1987;39:91-102.

41. Engel AG, Lambert EH, Gomez MR. A new myasthenic syndrome with end-plate acetylcholinesterase deficiency, small nerve terminals, and reduced acetylcholine release. Ann Neurol 1977;1:315-330.

42. Engel AG, Lambert EH, Mulder DM, Torres CF, Sahashi K, Bertorini TE, Whitaker JN. A newly recognized congenital myasthenic syndrome attributed to a prolonged open time of the acetylcholine-induced ion channel. Ann Neurol 1982;

11:553-569.

43. Engel AG, Ohno K, Bouzat C, Sine SM, Griggs RG. End-plate acetylcholine receptor deficiency due to nonsense mutations in the e subunit. Ann Neurol 1996;40:810-817.

44. Engel AG, Ohno K, Milone M, Wang H-L, Nakano S, Bouzat C, Pruitt JN, Hutchinson DO, Brengman JM, Bren N, Sieb JP, Sine SM. New mutations in acetylcholine receptor sub-unit genes reveal heterogeneity in the slow-channel congen­ital myasthenic syndrome. Hum Mol Genet 1996;5:1217-1227.

45. Engel AG, Ohno K, Sine SM. Congenital myasthenic syn­dromes. In: Engel AG, editor. Myasthenia gravis and myas­thenic disorders. New York: Oxford University Press; 1999. p 251-297.

46. Erickson JD, Varoqui H, Eiden LE, Schafer MK, Modi W, Diebler M, Weihe E, Rand J, Bonner TI, Usdin TB. Func­tional identification of a vesicular acetylcholine transporter and its expression from a 'cholinergic' gene locus. J Biol Chem 1994;269:21929-21932.

47. Finer-Moore J, Stroud RM. Amphipathic analysis and possi­ble formation of the ion channel in an acetylcholine recep­tor. Proc Nad Acad Sci USA 1984;81:155-159.

48. Frauenfelder H, Lesson DT. The energy landscape of non-biological and biological molecules. Nat Struct Biol 1998;5:

757-759.

49. Froehner SC, Luetje CW, Scotland PB, Patrick J. The postsynaptic 43K protein clusters muscle nicotinic acetylcho­line receptors in Xenopw, oocytes. Neuron 1990;5:403-410.

50. Fukudome T, Ohno K, Brengman JM, Engel AG. Quinidine normalizes the open duration of slow-channel mutants of the acetylcholine receptor. Neuroreport 1998;9:1907-1911.

51. GalziJ-L, Revah F, Black D, Goeldner M, Hirlh C, Changeux J-P. Identification of a novel amino acid o-tyrosine 93 within the cholinergic ligand-binding sites of the acetylcholine receptor by photoaffinity labeling. J Biol Chem 1990;265:10430-10437.

52. Gautam M, Noakes PG, Moscoso L, Rupp F, Scheller RH, Merlie MP, Sanes JR. Defective neuromuscular synaptogen-esis in agrin-deficient mutant mice. Cell 1996;85:525—535.

53. Gautam M, Noakes PG, Mudd J, Nichol M, Chu GC, Sanes JR, Merlie JP. Failure of postsynaptic specialization to de­velop at neuromuscular junctions of rapsyn-deficient mice. Nature 1995;377:232-236.

54. Glass DJ, Bowen DC, Stitt TN, Radziejewski C, BrunoJ, Ryan TE, Gies DR, Shah H, Mattson K, Burden SJ, Distefano PS, Valenzuela DM, Dechiara TM, Yancopoulos GD. Agrin acts via MuSK receptor complex. Cell 1996;85:513-523.

55. Gomez CM, Maselli R, GammackJ, LasaldeJ, Tamamizu S, Cornblath DR, Lehar M, McNamee M, Kunci R. A beta-subunit mutation in the acetylcholine receptor gate causes severe slow-channel syndrome. Ann Neurol 1996;39:712-723.

56. Gomez CM, Maselli R, StaubJ, DayJW, Cens T, Wollman RL, Charnet PC. Novel 8 and P subunit acetylcholine receptor mutations in the slow-channel syndrome demonstrate phe-notypic variability. Soc Neurosci Abstr 1998;24:484.

57. Gomez CM, Maselli R, Vohra BPS, Navedo M, Stiles JR, Charnet P, Schott K, Rojas L, Keesey J, Verity A, Wollman RW, Lasalde-Dominici J. Novel delta subunit mutation in slow-channel syndrome causes severe weakness by novel mechanism. Ann Neurol 2002;51:102-112.

58. Grady RM, Merlie JP, Sanes JR. Subtle neuromuscular de­fects in utrophin-deficient mice. J Cell Biol 1997;136:871-882.

59. Greer M, Schotland M. Myasthenia gravis in the newborn. Pediatrics 1960;26:101-108.

60. Grosman C, Salamone FN, Sine SM, Auerbach A. The extra­cellular linker of muscle acelylcholine receptor channels is a gating control element. J Gen Physiol 2000:116:327-339.

61. Harper CM. Electrodiagnosis ofendplate disease. In: Engel AG, editor. Myasthenia gravis and myasthenic disorders. New York: Oxford University Press; 2002. p 65-84.

62. Harper CM, Engel AG. Quinidine sulfate therapy for the slow-channel congenital myasthenic syndrome. Ann Neurol 1998;43:480-484.

63. Harper CM, Engel AG. Treatment of 31 congenital myas­thenic syndrome patients with 3,4-diaminopyridine. Neurol­ogy 2000;54 (Suppi 3):A395.

64. Harper CM, Engel AG, Fukudome T, Zochodne DW, Friedii WG. Treatment of slow channel congenital myasthenic syn­drome (SCCMS) with fluoxetine. Neurology 2002;58(Suppl 3):A329.

65. Hart Z, Sahashi K, Lambert EH, Engel AG, Lindstrom J. A congenital, familial, myasthenic syndrome caused by a pre-synaptic defect of transmitter resynthesis of mobilization. Neurology 1979;29:559.

66. Hercegfalvi A, Abicht A, Karcagi V, Lochmuller H. Case report: congenital myasthenic syndrome in a Gipsy family showing pseudodominant pattern of inheritance. Acta Myol 2000;19:49-51.

67. Hutchinson DO, Walls TJ, Nakano S, Camp S, Taylor P, Harper CM, Groover RV, Peterson HA.Jamieson DG, Engel AG. Congenital endplate acetylcholinesterase deficiency. Brain 1993;116:633-653.

68. Ishigaki K, Nicolle D, Krejci E, Osawa M, Guicheney P, Koenig J, Fardeau M, Eymard B, Hantai D. Two novel mu­tations in the ColQ gene causing endplate acetylcholinest­erase deficiency. Neuromuscul Disord 2001;! 1:666-667.