Вопросы метилирования

Methylation matters.

Joseph F Costello, Christoph Plass
J Med Genet 2001; 38:285-303

5'-метилцитозин, пятое азотистое основание.

Метилирование цитозина происходит путем ферментативного присоединения к нему метильной группы [1]. В ДНК млекопитающих, большая часть 5'-метилцитозинов сосредоточена в 5’-CpG-3’ динуклеотидах. В 98% генома, на каждые 80 динуклеотидов приходится один CpG [2]. В районах CpG островков, занимающих 1-2% генома, частота встречаемости CpG динуклеотидов в пять раз выше [6-10]. Островковые CpG в норме не метилированы, за исключением импринтированных генов и некоторых генов инактивированной хромосомы Х у женщин, в то время как, большинство CpG вне островков метилированы [12,13]. Гораздо реже метилированию могут подвергаться такие последовательности как 5’-CpNpG-3’ [3], 5’-CpA-3’и 5’-CpT-3’ [4].

Определенным этапам онтогенеза соответствуют разные состояния метилирования ДНК. В общем, ДНК женских половых клеток менее метилирована, чем мужских. Накануне формирования восьмиклеточной бластоцисты происходит общее деметилирование ДНК [18,19]. В течение имплантации ДНК метилируется de novo. У взрослых образец метилирования является ткане- и клеточно-специфичным. Получены доказательства, что изменение метилирования CpG островков генов, включая ген рецептора эстрогенов и ген MYOD1, имеют отношение к процессу старения [20]. У человека, образец метилирования основных регионов генома, видимо, является полиморфным и может наследоваться.

Аппарат метилирования.

В клетках млекопитающих обнаружены три ДНК метилтрансферазы – DMNT1, DMNT3A и DMNT3B [16,17]. Мышиные эмбрионы, гомозиготные по делеции Dnmt1 или Dnmt3B, погибают до рождения, делеция Dnmt3A приводит к смерти приблизительно на четвертой неделе после рождения [17,22]. Мыши, несущие гетерозиготную мутацию нормальны и фертильны [17,22]. Делеция Dnmt1 проявляет себя р53-зависимым апоптозом и массовой дисрегуляцией генной экспрессии [23].

Период раннего эмбрионального развития характеризуется метилазной активностью de novo для всех трех метилтрансфераз [5,17,25]. DMNT1 называют поддерживающей метилазой так как ее активность значительно возрастает на стадии полуметилирования ДНК. DMNT1 экспрессируется во всех соматических клетках [16]. Она взаимодействует с PCNA в репликационной вилке [26,27,28] и с HDAC2 и DMAP1 в протеиновых комплексах репрессии транскрипции [29].

Так как, на определенных этапах развития происходит стирание образца метилирования, предполагают наличие фермента с деметилирующей активностью [30-34]. Пассивное деметилирование можно представить как репликацию без участия поддерживающей метилтрансферазы.

Функции метилирования.

Метилирование регуляторных элементов, таких как промоторы, энхансеры, изоляторы и репрессоры, супрессирует их функцию. Метилирование отдельных регионов, таких как перицентромерный гетерохроматин, необходимо для поддержания конформации и целостности хромосом [37]. И, наконец, метилирование может служить защитой от мобильных элементов генома [38,39].

Предполагают наличие двух механизмов репрессии транскрипции. Первый – метилирование ингибирует связь транскрипционных факторов с сайтами узнавания, содержащими CpG [45,46]. Второй механизм вовлекает белки (МеСР2 и МеСР1), которые специфично связываются с метилированными CpG и ограничивают доступ транскрипционных факторов к регуляторным элементам [40,43]. Наиболее яркими примерами репрессии транскрипции путем метилирования являются импринтированные гены и гены инактивированной хромосомы Х. Промоторы, содержащие CpG островки большинства генов инактивированной хромосомы Х, включая гены HPRT, G6PD и PGK1, метилированы и транскрипционно не активны, что, видимо, обеспечивает равный уровень их экспрессии в мужских и женских клетках [49]. Однако метилирование скорее поддерживает неактивное состояние гена, чем инициирует его [50]. Экспрессия XIST коррелирует со статусом метилирования его промотора – на инактивированной хромосоме XIST не метилирован и экспрессируется, на активной хромосоме – XIST метилирован и молчит [48]. Импринтирование базируется на аллель специфичном метилировании CpG островков генов путем еще полностью не изученного механизма [53-58]. Так как образцы метилирования являются воспроизводимыми, постулировано наличие специфичной последовательности ДНК для связи с метилтрансферазами [59].

Изменение метилирования при болезнях.

Мутации в гене метилтрансферазы DNMT3B обнаружены у больных с синдромом ICF [17,66,67], мутации в CpG-связывающем протеине MeCP2 наблюдаются у больных с синдромом Ретта. Синдром ICF – редкое, аутосомно-рецессивное заболевание, характеризующееся иммунодефицитными состояниями и нестабильностью перицентромерного гетерохроматина в хромосомах 1, 9 и 16. У больных с синдромом ICF гипометилирована сателлитная ДНК [60-62]. Синдром Ретта является Х-сцепленным заболеванием, характеризующимся умственной отсталостью и аутичным поведением, и проявляется исключительно у девочек [68]. Мутации в гене MeCP2 обнаруживают в 2/3 спорадических случаев [69-72].

Дефекты метилирования импринтированных генов обнаружены при синдроме Беквита-Видемана, Прадера-Вилли и Ангельмана. В норме, гены PWS транскрибируются только с отцовского аллеля, а гены AS – с материнского. В критическом регионе PWS/AS идентифицировано несколько импринтируемых генов, включая отцовски экспрессирующийся SNRPN и матерински экспрессирующийся UBE3A [74-78]. Синдром Беквита-Видемана связывают с нарушением метилирования в кластере генов, расположенных в11р15.5, включая отцовски экспрессирующийся IGF2 и матерински экспрессирующийся H19 [79-82].

Геномика несбалансированного метилирования при опухолях.

Несбалансированное метилирование является распространенной причиной рака у человека [37,85-87]. Дефекты метилирования в опухоли представлены гипометилированием генома и аберрантным гиперметилированием CpG островков в определенных сайтах генома. Оба дефекта скорее предшествуют малигнизации, чем являются ее следствием.

Гипометилирование.

Подсчет количества 5’-метилцитозина в ДНК показывает общую тенденцию опухоли к гипометилированию [37]. Гипометилирование генома опухоли строго соответствует стадии малигнизации. Например, в опухолях молочных желез, яичников, шейки матки и мозга, гипометилирование возрастает по мере увеличения степени малигнизации [93-96]. Кроме того, изучение опухолей молочных желез показало выраженную корреляцию между протяженностью гипометилирования и стадией развития опухоли [97]. Таким образом, гипометилирование можно расценивать как биологический маркер, имеющий прогностическое значение. Гипометилирование обнаружено в геномах клеток при различных болезнях, таких как гастрит, колит, [98,99]. Замечено, что уровни гипометилирования в доброкачественных полипах и аденокарциноме толстого кишечника являются сходными [100].

Предложено несколько гипотез влияния гипометилирования на транскрипционную активность онкогенов [101,102], активацию транспозонов [103-107] и нестабильность хромосом [37].

Активация онкогенов. Предполагают, что гипометилироваие может обеспечивать селективное преимущество клеткам опухоли [102]. Такие клетки активно размножаются и становятся ведущей популяцией. При первичном раке обнаруживают большое количество гипометилированных генов [101], включая такие известные онкогены как CMYC [108] HRAS [108,109]. Гипометилирование сопровождается транскрипционной активностью большой группы генов – MAGE, GAGE, CTAG/LAGE и SAGE семейств [110-112]. Гены MAGE, являющиеся прототипом этой группы, кодируют опухоль специфические антигены, распознаваемые цитолитическими Т-лимфоцитами [113-115]. Гены MAGE не метилированы в клетках сперматогенного эпителия, но метилированы во всех соматических клетках, включая оба аллеля хромосомы Х [116]. Деметилирование MAGE ведет к активации их транскрипции в клетках опухоли [118]. Экспрессия генов MAGE может стимулировать продукцию анти-MAGE Т-лимфоцитов. Таким образом, возможно, что вместо обеспечения селективного преимущества, гипометилирование повышает противоопухолевый иммунитет.

Мобильная ДНК. Гипометилирование в клетках опухоли может приводить к транскрипционной активности мобильных элементов генома, именуемых транспозонами [103-106]. Самыми частыми среди них являются LINE [119,120]. Деметилирование промоторов и транскрипционную активность LINE обнаруживают при различных типах спорадического рака [103-106]. Инсерционные мутации LINE описаны при опухолях толстого кишечника и груди [121,122]. При раке груди, яичников и толстого кишечника также наблюдали инсерционные мутации Alu [123-125]. Очевидно, роль геномного метилирования в перемещении транспозонов не является решающей, но накоплены доказательства транскрипционной активности транспозонов в метил-зависимой манере [23,39,126,127].

Хромосомная нестабильность. Гипометилирование специфических хромосомных областей также связано с хромосомной нестабильностью [37]. В нормальных клетках перицентромерные гетерохроматиновые регионы на хромосомах 1 и 16 сильно метилированы. В аденокарциномах груди, эпителиальных опухолях яичника и спорадических опухолях Вильямса эти регионы являются гипометилированными и, обычно, нестабильны [94,96,128]. Нестабильность гетерохроматиновых регионов хромосом 1, 16 и 9, появляется также при обработке клеток деметилирующими агентами [60,130].

Поступили фолаты?При изучении неопластических процессов у крыс и человека были получены доказательства того, что гипометилирование ДНК и нестабильность хромосом могут быть результатом недостаточности фолатов в пищевом рационе [133-137]. Фолаты обеспечивают продукцию универсального донора метильных групп S-аденозинметионина (SAM). Уровень метилирования генома может определяться генетическими факторами, участвующими в метаболизме SAM, например мутациями гена метилтетрагидрофолатредуктазы (MTHFR). У гомозигот по мутации значительно снижен уровень геномного метилирования в периферических лейкоцитах [138]. Выдвинута гипотеза о взаимосвязи сниженной активности MTHFR и аномальной сегрегации хромосом в оогенезе у молодых матерей [139]. Специфический полиморфизм MTHFR также ассоциируется с повышенным риском дефектов нервной трубки [140-142]. Существуют эпидемиологические доказательства того, что достаточное содержание фолатов в диете уменьшает риск развития определенных опухолей [143].

Гиперметилирование CpG островков.

Гены кандидаты. Метилирование CpG островков промоторов может инактивировать оба аллеля онкогена или действовать совместно с генетическими механизмами, включая точечные мутации и делеции. Деметилирующие агенты способны восстанавливать активность гена и функцию супресии опухоли в культуре опухолевых клеток. Восстановление активности генов-супрессоров опухоли рассматривается как альтернатива генной терапии [144]. Есть доказательства, что метилирование CpG островков напрямую способствует малигнизации [85,86,147].

Онкологические последствия может иметь дисрегуляция некоторых импринтированных генов [148]. Полная потеря функции импринтированного гена происходит при делеции единственного активного аллеля, как показано для ингибитора p57 KIP2 циклин зависимой киназы при раке легкого [149], H19 при опухоли Вильямса [150], и NOEY2 семейства RAS при раке груди и яичника [151]. Инактивация импринтированного гена, также может наступить при унипарантной дисомии по безмолвному аллелю [148, 152].  Потеря импринтирующего сигнала проявляется в виде биаллельной экспрессии гена, как показано для IGF2 при опухоли Вильямса [150, 153-155] и колоректальном раке [156].

Метиломика рака. Гены рака могут быть инактивированы точечными мутациями, делециями и метилированием. Для определенных генов часто преобладает какой-либо один механизм инактивации. Например, ген-супрессор опухоли р16 инактивируется в основном гомозиготной делецией, ген р53 - делецией в одном аллеле и точечной мутацией в другом. Ген может быть инактивирован метилированием обеих аллелей. При скрининге генома на метилирование [162,165-175], среднее количество  метилированных CpG островков на опухоль составило 600, с разбросом от 0 до 4400 [172] при разных стадиях и типах опухолей.

Метиломика исследует образцы метилирования. Например, в опухоли может обнаруживаться предпочтительное метилирование CpG островков [172]. Отмечена клональная экспансия клеток с аберрантным гипометилированием [159]. Тип развития опухоли какой-либо ткани может определяться метилированием специфических генов [172,176-178]. Гомозиготное метилирование специфических генов наблюдается даже на ранней стадии малигнизации [87,172,176,179,180]. Статистически показано, что метилирование одного аллеля является фактором, предрасполагающим к метилированию второго аллеля того же гена. Спаривание метилированного и неметилированного аллеля во время мейоза может привести к состоянию временного гипометилирования [87].

Если метилирование гена приводит к развитию опухоли, то ожидается что: 1) в нормальных клетках, дающих начало опухоли, ген экспрессируется; 2) уровень метилирования является достаточным для снижения экспресии гена; 3) реэкспрессия гена изменяет фенотип клетки. Если метилирование является единственным механизмом инактивации гена, то экспериментальное деметилирование с помощью 5-аза-2-дезоксицитидина должно реактивировать его экспрессию.

Метиломика и геномика. Специфичность аберрантного метилирования поднимает важный вопрос соотношения генетических и эпигенетических механизмов в опухолях человека. В опухолях часто наблюдают аберрантное метилирование генов MLH1 и 14-3-3σ, важных для целостности генома [91,185-191]. Ген MLH1 кодирует белок репарации ошибок синтеза ДНК. Потеря функции MLH1 при раке толстого кишечника ассоциируется со 100-кратным увеличением частоты мутаций по всему геному, особенно в микросателлитных последовательностях [192,193]. Метилирование MLH1 наблюдается при спорадическом раке толстого кишечника, эндометрия и наследственных формах рака кишечника и желудка [91,190]. Ген 14-3-3σ косвенно вовлечен в поддержание целостности генома. Его белок индуцирует арест G2 следующей за повреждением ДНК [196]. Метилирование14-3-3σ находят в 91% опухолей груди [185,187,188].

При раке легкого делеция одного аллеля гена RASSF1A в 90% случаев сопровождается метилированием промотора второго аллеля [204]. Более того, ген RASSF1A действует как супрессор опухоли при реэкспрессии [205].

В нескольких исследованиях была показана корреляция между аберрантным метилированием CpG островка и местом хромосомной поломки. Эти события происходят в одном и том же аллеле, но в разное время развития опухоли. Возможно, аберрантное метилирование создает условия для делеции, либо отражает подверженность нестабильного хроматина метилированию. Например, гиперметилирование наблюдается в кластерном регионе поломок у больных с филадельфийской хромосомой, но не в нормальных предшественниках миелоидного ряда [206,207]. Гиперметилирование также отмечено в ломком сайте FRA11B при синдроме Якобсена [208,209], и в кластерном регионе поломок 17p11.2 при медулобластоме [169].

Механизмы возникновения аберрантных CpG островков.

Метилирование.Существуют две модели метилирования CpG островков при раке [85-87]. Одна предполагает потерю нормальных факторов защиты от метилирования. Защитными факторами являются структурные белки [212] или транскрипционные факторы [213,214], которые конкурируют с метилтрансферазой за сайты связывания в CpG островке. Вторая модель рассматривает аберрантное метилирование как активный процесс. Изучение опухолей показывает, что они имеют повышенную активность поддерживающей метилтрансферазы DNMT1. Эту модель подтверждает трансформация NIH3T3 клеток при экспериментальном увеличении экспрессии мышиного Dnmt1 [223]. Экспрессия DNMT1 в фибробластах человека может привести к массивному метилированию CpG островка [184]. Ингибирование метилтрансферазы уменьшает туморогенность адренокортикальных опухолевых клеток мыши [224].

Метилирование ДНК и горячие точки мутаций.Мутации в гене р53 обнаружены в 505-и типах опухоли человека [227,228]. В этом гене найдено более 10000 мутационных событий, которые суммированы в базе данных [229]. Ген р53 содержит 23 нормально метилированных CpG динуклеотида в пределах региона, кодирующего ДНК связывающую область. Эти CpG составляют только 8% всего гена р53, но 33% мутаций в этом регионе обнаружены в них [230]. Влияние экзогенных факторов подтверждается наличием горячих специфических точек мутаций [227,236]. Например, мутации в кодонах 175, 248 и 273 находят при раке груди, яичников и ротовой полости, лейкемии и лимфоме [227,236], кодон 157 является горячей точкой при раке легкого у злостных курильщиков [237-239].

Раннее выявление, предупреждение и классификация рака.Сделаны попытки изучения молекулярных маркеров рака. Это изучение основано на допущении, что образец метилирования участков гена детерминирован. Молекулярные маркеры могут быть использованы для предсказания поведения опухоли, например резистентности к лекарствам, возникновению метастазов или для раннего выявления опухоли или ее рецидива.

Гиперметилирование промотора гена BRCA1 было эксклюзивно обнаружено при раке груди и яичников [242]. Гиперметилирование промотора гена VHL найдено только в линии клеток карциномы почек [176]. Метилирование промотора гена р15 является частым событием при остром миелоидном и лимфоидном лейкозе [243], промотора р53 – при лимфоме Ходжкина.

Изменения метилирования предшествуют малигнизации опухоли и, таким образом, могут быть использованы для выявления потенциально канцерогенных клеток. Например, метилирование р16 может быть ранним маркером рака легкого и мониторинга при лечении [244,245]. Метилирование р16 и MGMT в клетках слюны курильщиков возникает за три года до клинического развития карциномы легких [246]. В других исследованиях показано раннее метилирование промотора гена MLH1 при раке эндометрия [247], р16 при раке простаты [248] и гиперметилирование хромосомы 16 при гепатоцеллюлярной карциноме [249].

Маркеры метилирования могут быть использованы для предсказания ответа на химиотерапию или продолжительность жизни пациента. Метилирование CpG островка в гене WIT1 коррелирует с химиорезистентным фенотипом при остром миелоидном лейкозе [170]. Метилирование гена проапоптоза DAP предсказывает специфическое выживание пациентов с раком легкого [250]. Метилирование гена MGMT предсказывает резистентность опухоли мозга к алкилирующим агентам [251]. Метилирование промотора АРС в плазме больных с аденокарциномой ассоциировано со снижением продолжительности жизни [252].

Библиография 330 источников.

Референт – Осипова Г.Р.

Библиография может быть выслана по e-mail: genetics@rusmedserv.com