Цитогенетика человека: 46 хромосом, 46 лет и результаты

Human Cytogenetics: 46 Chromosomes, 46 Years and Counting.

Barbara J. Trask
Nature reviews, 2002. 3:769-778

Цитогенетика человека начинает свой отсчет с открытия, сделанного в 1956 году, когда Tjio и Levan [1] добавив воду к суспензии митотических клеток человека перед их фиксацией на стекле, смогли отделить хромосомы друг от друга и сосчитать их количество. Независимо от их исследования, в том же году, число хромосом человека - 46, было установлено Ford и Hamerton [2]. Появившаяся методика дала толчок развитию исследований в области цитогенетики человека и определила ее место в медицине.

В последующие годы цитогенетические исследования были дополнены достижениями технологического прогресса в молекулярной биологии и химии, что позволило значительно расширить знания о геноме человека. Введение дифференциального окрашивания хромосом и, позже, флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) увеличило разрешающую способность анализа более чем в 10 000 раз. В настоящее время, благодаря применению цветового окрашивания, каждая хромосома может быть легко распознана даже в сильно перестроенном кариотипе клеток опухоли.

Цитогенетикам стали доступны для анализа сложные и минимальные изменения хромосом. Появились методики, которые дают возможность оценить кариотип в неделящихся клетках. Благодаря исследованиям в цитогенетике стало возможным получение изолированных хромосом для молекулярного анализа, что предопределило всестороннее изучение геном человека, картирование генов и идентификацию мутаций.

В данной статье отражены главные технологические достижения цитогенетики человека за последние 46 лет.

Позднее начало, но быстрое развитие.

Впервые хромосомы человека наблюдали Flemming и Arnold в 1880-х годах, однако их количество было установлено лишь в 1956 году, спустя три года после открытия структуры ДНК [5]. Фогель и Мотульски [5] объясняют столь значительную задержку во времени отсутствием должного интереса к генетике человека, а также периодом господства евгеники. Тем не менее, вскоре после того, как число 46 было установлено, ученые активно начали использовать появившуюся методику для изучения фенотип-цитогенетических корреляций у человека. Исследования в этой области шли несколько медленно из-за морфологического сходства хромосом человека  с хромосомами мыши, и их количественного сходства с большинством птиц. К счастью различия в относительном размере, а также в расположении центромер позволили выделить 23 пары хромосом и классифицировать их в семь групп (A-G) [7]. Уже на этом этапе были сделаны выводы о том, что некоторые болезни человека являются результатом изменений количества или структуры хромосом. Так в 1959 году было показано, что причиной синдрома Дауна является трисомия хромосомы 21 [8], а аномалии количества половых хромосом приводят к развитию синдрома Тернера и синдрома Клайнфельтера [9,10]. Установлено, что большинство выкидышей обусловлено количественными изменениями хромосом [11].

Работа над миниатюрной, но опасной «Филадельфийской» хромосомой установила новую модель поиска генов. «Филадельфийскую» хромосому как причину хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) идентифицировали в 1960 году [12]. Спустя тринадцать лет, благодаря появлению молекулярного анализа, Janet Rowley  обнаружила, что она является продуктом транслокации между хромосомами 9 и 22 [13], а в 1985 году, в месте слияния этих хромосом, был идентифицирован новый гибридный ген, состоящий из BCR и ABL [14]. Дальнейшие исследования показали, что активация BCR-ABL тирозинкиназой лежит в основе патогенетических механизмов развития фенотипа болезни [15]. Это открытие способствовало созданию лекарства, которое блокирует функцию белка BCR-ABL и с успехом применяется для лечения больных ХМЛ [16].

Изучение первых препаратов хромосом человека в начале 1960-х способствовало и другим открытиям в генетике человека. Так Lejeune в 1963 году описал первый делеционный синдром – cri du chat - потерю порции короткого плеча хромосомы 5 у больных с выраженной задержкой умственного развития и плачем, похожим на крик кошки [17]. В том же году у больного с билатеральной ретинобластомой была обнаружена делеция длинного плеча одной из хромосом группы D [18]. Позже, благодаря работам Cavenee et al. [19] появилась гипотеза двух шагов, которая гласит, что к развитию новообразования приводит сначала потеря одного аллеля гена RB, локализованного  в 13q14, а затем мутация другого аллеля. Вследствие обнаруженного наследуемого цитогенетического изменения прицентромерного региона хромосомы 1 был впервые картирован аутосомный ген человека – ген группы крови Duffy [21].

«Штриховые коды» хромосом.

Цитогенетические исследования получили новое развитие в конце 1960-х годов благодаря работам Torbjorn Caspersson, который разработал протоколы дифференциального окрашивания, дававшие паттерн из темных и светлых полос по всей длине каждой хромосомы [22]. В прометафазе, когда хромосомы находятся на очень ранней стадии конденсации, можно было насчитать до 2000 полос, в других случаях - 400-800 полос. Эта окраска позволила цитогенетикам легко идентифицировать хромосомы, выявлять делеции, инверсии, инсерции, транслокации, фрагильные сайты и другие более сложные перестройки. Для дифференциального окрашивания можно было использовать только метафазные хромосомы, и, следовательно, делящиеся клетки. В 1871 году было принято соглашение о единой системе нумерации при дифференциальной окраске и ее использовании для обозначения хромосомных изменений. [24]. Как стало ясно позже, «полосатость» хромосом коррелирует с насыщенностью различными основаниями, повторяющимися элементами, временем репликации и плотностью упаковки хроматина.

В конце 1960-х годов стало понятно, что фетальные клетки, полученные посредством амниоцентеза, могут быть использованы для выявления хромосомных аномалий плода. Методы исследования фетальных клеток развивались достаточно быстро, благодаря этому были открыты тысячи хромосомных аномалий, которые сделали возможным изучение молекулярных основ болезней и картирование генов.

От микроскопа к молекуле.

Следующим шагом после идентификации аномальной хромосомы является определение точки транслокации или границы делеции на молекулярной карте относительно генов. Для этого используются три подхода: технология гибридных соматических клеток, активизированная флюоресценцией сортировка клеток (хромосом) (FACS)и FISH. Эти методы обеспечивают грубое картирование, предваряющее более детальный молекулярный анализ и секвенирование.

Гибридизация соматических клеток является счастливой причудой клеточной биологии. Группа Weiss и Ruddle установила, что при слиянии клеток хомячка и человека, происходит преимущественная  элиминация хромосом человека [25, 26], что дает возможность получать линии гибридных клеток, в каждой из которых остаются различные хромосомы [27, 28]. Основой для картирования многих генов послужили линии, содержащие аберрантные хромосомы клеток пациентов [29] или фрагменты, полученные при воздействии радиации [30].

Жидкостная цитометрия, обычно используемая для анализа и разделения клеток, в 1979 году группой исследователей в Lawrence Livermore National Laboratory (Калифорния) была адаптирована для количественного анализа и сортировки хромосом [31]. Этот метод позволяет отобрать все, кроме четырех хромосом человека [9-12, 32] и получить информацию о вариабельности их размеров [33, 34]. Жидкостной сортинг лежал в основе создания библиотеки клонов хромосом-специфичной ДНК [36, 37], которая используется для построения физической карты генома. [38, 39].

Экскурс в FISH метод.

Следующим революционным достижением цитогенетики был метод FISH, который обеспечил прямую связь между микроскопом и секвенированием. Эта техника позволила увидеть хромосомную локализацию специфических последовательностей ДНК с помощью микроскопа [42, 43]. Прогрессивность методики заключалась в замене радиоактивного мечения ДНК и РНК проб, применяемого с 1969 года [40, 41], на флюоресцентное [42, 43]. Флюоресцентные красители являются мягкими и простыми в употреблении, могут храниться неопределенно долго, дают высокое разрешение, и позволяют одновременно исследовать несколько последовательностей ДНК.

Для картирования гена нерадиоактивная гибридизация in situ была впервые применена в 1985 году [44]. Этот шаг был важной вехой, так как картированный ген тироглобулина был одним из самых крупных и из использованной пробы, пришлось тщательно удалять все повторяющиеся элементы. Техника FISH продолжала совершенствоваться, и сегодня локализация сегментов длиною10 kb считается рутинной, а - 1 kb вполне достижимой [41, 45, 46]. Одним из последних достижений FISH является использование проб, состоящих из пептидов и нуклеиновых кислот, которые позволяют по интенсивности сигнала определять количество комплементарных последовательностей. Хорошей иллюстрацией является изучение динамики теломер в клетках с использованием TTAGGG-специфических проб к концам хромосом [47]. Использование COD-FISH позволяет определять инверсии и сестринские хроматидные обмены [49, 50].

Появление FISH расширило возможности картирования генома, в частности идентификацию малых хромосомных аномалий [51]. Метод FISH используют для упорядочивания ДНК клонов и идентификации точек разрыва [52], оценки построенных карт [53], идентификации поврежденных генов в больших коллекциях картированных сегментов генома человека - космидных, BAC, PAC и YAC. Например, FISH анализ клонов, содержащих перицентрическую инверсию хромосомы 16, обнаруживаемую у пациентов с острой миелогенной лейкемией, привел к идентификации двух генов (MYH11, тяжелой цепи 11 миозина гладких мышц, и CBFB, b-субъединицы ядерно-связывающегося фактора), которые, сливаясь, могут стать причиной лейкемической трансформации [54, 55]. FISH методика легла в основу открытия импринтинга генов региона 15q11-15q13 при синдромах Ангельмана и Прадера-Вилли [56, 57].

Широкое изучение генома с применением FISH метода выявило дуплицированные последовательности в удаленных участках генома, представляющие биологический интерес, с точки зрения причины хромосомных перестроек [58].

Что еще более важно, FISH сделала доступными для цитогенетического анализа ядра не делящихся клеток. Идентификация хромосом осуществляется простым подсчетом сигналов в каждом ядре [59,60]. Изменение числа сигналов свидетельствует о произошедшей делеции или амплификации гена. Так дупликация длиной 1Mb, которая является причиной синдрома Шарко-Мари-Тус [61], может быть определена интерфазной FISH. Позиционные сдвиги сигналов выявляют структурные перестройки, такие как транслокации и инверсии [62].

Интерфазная FISH делает возможным определение относительного количества специфических ДНК последовательностей, которые реплицируются в течение S фазы клеточного цикла [63]. Подобные исследования показали, что большинство материнских и отцовских аллелей локусов реплицируются синхронно, в то время как, для аллелей  импринтированных локусов, характерна асинхронизация процесса - экспрессирующиеся аллели реплицируются раньше, чем молчащие аллели [64].

Методом FISH можно различать последовательности ДНК, находящиеся на расстоянии 50-100 kb друг от друга [65]. Последним достижением цитогенетики является использование FISH на нитях ДНК, фиксированных на стекле [66, 67]. При этом маленький сигнал виден в интерфазу в световой микроскоп как флюоресцирующая линия. Эта модификация FISH используется для определения двойственности порядка генов в хромосомном регионе, для анализа организации тандемных дупликаций и определения малых перестроек в хромосомах.

В лабораториях клинической цитогенетики FISH используют с диагностической и исследовательской целью. В настоящее время созданы коммерческие наборы проб, пригодные для решения различных задач, например для диагностики синдрома, обусловленного малой хромосомной аномалией, незаметной при обычном дифференциальном окрашивании. Исключительным примером является использование пробы для идентификации малой делеции хромосомы 17 при диагностике синдрома Смит-Магенис.

Многоцветное окрашивание хромосом.

Последним достижением цитогенетических технологий является анализ многоцветно окрашенных хромосом [69, 70]. Новая методика, получившая название спектрального кариотипирования (SKY) или мультиплексной FISH (M-FISH), появилась в результате трех новшеств. Во-первых, были созданы хромосом-специфические «краски»: коллекции последовательностей, выделенных из каждой хромосомы [71, 72]. Во-вторых, за счет сочетания флюорохромов, для каждой хромосомы получена своя 24-х цветовая комбинация [75]. В-третьих, для многоцветного анализа усовершенствована техника оптической микроскопии, системы фильтрации и отображения, позволяющая автоматически классифицировать каждый хромосомный сегмент [69, 70].

SKY и М-FISH обладают высокой эффективностью выявления транслокаций и других сложных аберраций, например, репликации регионов 11q, 21q и 22q при остром миелоидном лейкозе [76]. Эти методы активно применяют для изучения репарации хромосомных поломок, возникших под воздействием радиации [78]. Они являются пригодными и для радиационной дозиметрии и для понимания пространственной организации хромосом в ядре [79]. Метод М-FISH позволяет идентифицировать многие ранее не известные перестройки хромосом, особенно их концов [80, 81].

Одним из наиболее интересных направлений цитогенетики сегодня является изучение эволюционных перестроек хромосом [82, 83]. События, произошедшие в эволюции, могут быть воспроизведены [84]. Реконструкция этих событий, а также сравнительнй анализ геномов помогает картировать гены заболеваний человека, например различные формы рака, глухоты, болезней сердца, слепоты и эпилепсии [85, 86].

Множественная CGH - заменитель хромосом.

Следующей трансформацией цитогенетики является реализация широкого сканирования генома на потерю или увеличение хромосомного материала без прямого осмотра хромосом. Техника, которая делает это возможным, называется сравнительная геномная гибридизация (CGH), разработана командой Ollie и Anna Kallioniemi, Dan Pinkel и Joe Grey [87]. При этой методике конкурирующие за связывание образцы геномной ДНК метятся красным и зеленым цветом. Соотношение красная-зеленая флюоресценция измеряется вдоль длины каждой хромосомы. Хромосомные регионы, которые эквивалентно гибридизуются с двумя образцами выглядят оранжевыми, а те, которые делетированы или амплифицированы - более красными или более зелеными. Техника CGH используется для изучения цитогенетики рака, например, CGH идентифицируют PIK3CA, каталитическую субъединицу фосфатидилинозитол3-киназы (PI3A), как онкоген рака яичников [88]. ДНК-амплификационная техника также развивается для поиска генетических изменений в редких клетках [89], например, в «рогатых» клетках крови, являющихся предвестниками метастазирования опухоли.

В настоящее время цитогенетика вынашивает идею множественной-CGH [90]. При этой технике, метафазные хромосомы перемещаются в тысячи BAC клонов, каждый из которых содержит сегмент генома  длиной около 150 kb. Весь геном может быть помещен в 3000 BAC [53]. Таким образом, множественная-CGH эквивалентна одновременному проведению тысячи FISH. Множественная-CGH обеспечивает лучшее определение количества копий и более точную информацию о точках поломки в сегментах, которые потеряны или увеличены, чем простая CGH. Что еще более важно, каждый клон – это точка доступа к геномной последовательности, в которой могут быть идентифицированы пораженные гены. Несмотря на то, что CGH нечувствительна к изменениям, которые встречаются с низкой частотой в анализируемых клетках, ожидается, что множественная-CGH позволит многим группам оценить большее число опухолей на текущие изменения, используя общую платформу. Этот анализ может обнаружить прогностические маркеры, идентифицировать новые опухоль-супрессирующие гены или онкогены и, наконец, глубже понять механизмы развития рака. Кроме того, автор предполагает, что некоторые пренатальные диагностические тесты, которые в настоящее время используют FISH, также могут быть дополнены вариантами CGH. Есть надежда, что прогрессивные технологии, такие как множественная-CGH, сократят время и стоимость цитогенетического анализа, что сделает его доступным большему числу семей.

Иллюстрации к статье представлены здесь:
http://www.nature.com/nrg/journal/v3/n10/slideshow/nrg905_F4.html