КЛАССИЧЕСКИЙ, НЕОБЫЧНО ТЯЖЕЛЫЙ И НЕОНАТАЛЬНЫЙ СИНДРОМ МАРФАНА: ДВЕНАДЦАТЬ МУТАЦИЙ В ЭКЗОНАХ 24-40 ГЕНА FBN1 И ГЕНОТИП-ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ КОРРЕЛЯЦИИ
Classic, atypically severe and neonatal Marfan syndrome: twelve mutations and genotype-phenotype correlations in FBN1 exons 24-40

F.Tiecke, S. Katzke, P. Booms, P.N. Robinson, L. Neumann, M. Godfrey, K.R. Mathews, M. Scheuner, G.K. Hinkel, R.E. Brenner, H.H. Hovels-Gukich, C. Hagemeier, J. Fuchs, F. Skovby, T. Rosenberg
European Journal of Human Genetics (2001) 9, 13-21.
e-mail: peter.robinson@charite.de

Сокращения: FBN-1 - fibrillin-1; EGF - epidermal growth factor; cbEGF - calcium binding EGF; LTBP - latent transforming growth factor- ?-1 binding protein; ПЦР - полимеразная цепная реакция; ССА - congenital contractural arachnodactyly;

Введение

Синдром Марфана (СМ) является наследственным заболеванием, характеризующимся поражением соединительной ткани. Признаками болезни являются истинная или расслаивающая аневризма аорты, сколиоз, деформация грудной клетки, арахнодактилия, долихостеномелия и билатеральный подвывих хрусталиков. Однако возраст манифестации заболевания, количество аномалий и их сочетание широко варьируют как внутри семьи, так и между семьями [1]. Подтвердить диагноз можно путем выявления сегрегации патогномоничных признаков болезни в семье и идентификации мутации в гене FBN1 [2].

Ген FBN1 расположен в локусе 15q21.1, занимает участок геномной ДНК длиной 200 kb, содержит 65 экзонов и кодирует белок фибриллин-1 [2,3,4]. Фибриллин-1 - это гликопротеин с молекулярной массой 320 kD, являющийся главным компонентом внеклеточных миофибрилл. Он содержит 47 мотивов, гомологичных эпидермальному фактору роста человека (EGF); 43 из них имеют консенсусные последовательности для связывания ионов кальция (cbEGF). Последовательности cbEGF расположены тандемно по 12 штук, эти тандемы прерываются другими последовательностями, включая семь, гомологичных белок-связывающему латентному трансформирующему фактору роста ?-1 (LTBP) [5].

В гене FBN1 найдено более 137 мутаций [6], большая часть которых обнаружена в единственном числе. Мутации встречаются во всех регионах гена, преобладающими являются миссенс-мутаций в консервативных последовательностях cbEGF. Достаточно часто также встречаются мутации в сайтах сплайсинга, приводящие к потере экзона при процессинге РНК [7]. Мутации в гене FBN1 обнаружены не только у больных с СМ, но и при других сходных болезнях соединительной ткани, объединенных в группу фибриллинопатии 1 типа. В эту группу включены: неонатальный синдром Марфана (нСМ), эктопия хрусталиков, изолированные деформации скелета, семейные случаи аневризмы восходящей аорты [5].

Методы

Геномная ДНК была получена от 124 неродственных пробандов с СМ [2,8]. Наряду с пробандами, имеющими классическое проявление СМ, в исследуемую группу были включены: пробанд с нСМ, описанный ранее [9]; двое пробандов с необычно тяжелой манифестацией болезни; двое с достаточно легким течением болезни [10]; и один пробанд у которого эктопия хрусталиков сочеталась с гиперподвижностью суставов.

Последовательности экзонов 24-40 гена FBN1, вместе с экзон/интронными границами, были получены методом ПЦР [11]. Продукты амплификации анализированы методом температурно-градиентного гель-электрофореза [12,13]. Для идентификации мутаций, образцы с измененными характеристиками были секвенированы.

Результаты

Всего обнаружено 12 мутаций, среди них 10 были описаны впервые. Мутация G1013R, во втором экзоне, идентифицирована в двух неродственных семьях, в которых у пробандов наблюдалось необычно тяжелое течение болезни. У одного из них в возрасте трех лет проведено оперативное лечение аневризмы аорты. У другого пробанда болезнь закончилась летальным исходом в возрасте 16 лет вследствие осложнений, сопутствующих оперативному восстановлению корня аорты. В обоих случаях мутация возникла de novo, поскольку она не была обнаружена у клинически здоровых родителей пробандов.

Мутации T1020A и IVS 24+1g-t идентифицированы у пробандов с классическим вариантом СМ. Другие мутации: две нонсенс (E1325X; R1539X) и шесть миссенс (D1115G; D1238G; K1300E; D1406G; C1408F; C1652Y), приводящие к замене аминокислот в разных cbEGF модулях, также обнаружены у пробандов с классическим вариантом СМ. Косегрегация мутации с фенотипом болезни установлена во всех случаях, когда были доступны для исследования образцы родственников пробанда.

Идентифицирован новый нейтральный полиморфизм в экзоне 26 (С3294Е; N1098N). Частота встречаемости данного аллеля среди пробандов составила 1,5%. Наряду с этим определена частота аллелей известного полиморфного повтора (ТТТТА)n в интроне 28 [14]: 87% (6 повторов), 13% (5 повторов) и 0,4% (8 повторов). Гетерозиготность по данному локусу среди пробандов составила 25%.

У 7-летней девочки с бикуспидальным аортальным клапаном и умеренно выраженной дилятацией корня аорты (27 мм) обнаружено изменение нуклеотидной последовательности - Т3368А, приводящее к замене глутаминовой аминокислоты на лизин в позиции 1123 (L1123Q). Эта замена не обнаружена у других пробандов с СМ, а также среди индивидов контрольной группы, однако, она была найдена у клинически здорового 10-летнего брата пробанда, и, вероятнее всего, является полиморфизмом.

Обсуждение

G1013R: относительно частая мутация среди пробандов с необычно тяжелым течением СМ. Эта мутация впервые найдена у больного с выраженными сердечно-сосудистыми изменениями, обусловленными поражением всех клапанов сердца и аневризмой аорты. Наряду с этим у него были обнаружены тяжелые скелетные деформации и подвывих хрусталиков [17]. Авторы данной статьи идентифицировали мутацию G1013R у двух пробандов с тяжелой формой СМ, а также у больного, не вошедшего в исследованную группу [15]. Таким образом, мутация G1013R описана всего у четырех неродственных больных, каждый из которых имел необычно тяжелое течение болезни, и может быть определена как минорная горячая точка при этом фенотипе. Регион, в котором локализуется мутация G1013R, является консервативным для фибриллинов 1 и 2 типов, и определяет эластичность белка [18,19].

Другая мутация - Т1020А, приводящая к замене гидрофобной аминокислоты аланин на полярную аминокислоту треонин, идентифицирована в семье с различной экспрессивностью классического варианта СМ.

Таким образом, вместе с мутацией K1023N, обнаруженной у больного с нСМ [21], всего описаны три мутации, локализованные в последовательности расположенной между LTBP №3 и cbEGF №11, подтверждая, что этот регион играет важную роль в осуществлении нормальной функции фибриллина-1.

Необычно тяжелое течение синдрома Марфана. Putnam et al. [22], а также авторы данной статьи считают, что есть определенный резон ввести клиническую классификацию СМ, в которой следует выделить неонатальную и необычно тяжелую форму заболевания на основании возраста манифестации сердечно-сосудистой патологии. Критерием необычно тяжелой формы болезни следует считать сердечно-сосудистые осложнения, требующие хирургического вмешательства в детском возрасте (до 16 лет). Помимо этого признаками данной формы могут быть аномалии развития лицевой части черепа, ушей и врожденные контрактуры суставов. Пробанды с необычно тяжелой формой СМ, могут представлять собой гетерогенную группу по другим признакам болезни (Таблица 1).

У большинства пробандов с необычно тяжелой формой СМ мутации были найдены в экзонах 24-32. Кластерное расположение мутаций, ассоциированных с тяжелой формой болезни, указывает на важную роль данного региона в осуществлении функций белка.

С тяжелым течением болезни, включая нСМ, также ассоциируются мутации, приводящие к сплайсингу экзонного участка гена [24]. Очевидно, последствием таких мутаций является нарушение процесса полимеризации фибриновых мономеров. Однако не все описанные сплайсинг-мутации обнаружены у больных с тяжелой формой СМ. Авторы статьи представляют новую мутацию, повреждающую инвариантный донорный сайт сплайсинга 24 интрона и приводящую к пропуску экзона 24. Она идентифицирована у 33-летнего больного с классическим вариантом СМ. Эта мутация должна приводить к делеции LTBP № 3 таким образом, что возникает тандемное образование из 13 cbEGF мотивов, кодирующихся экзонами 23 и 25-36.

Кластерное расположение мутаций в 24-32 экзонах гена FBN1. Мутации в экзонах 24-32, кодирующих cbEGF мотивы, найдены у пробандов с классическим, неонатальным и необычно тяжелым вариантом СМ. Поэтому, установление корреляции между генотипом и фенотипом при СМ является трудной задачей. Тяжесть фенотипического проявления болезни также не коррелирует и с характером изменения аминокислотной последовательности. Несмотря на это, авторы подчеркивают что, миссенс-мутации при нСМ чаще находят в 25 и 26 экзонах. Миссенс-мутации, ассоциирующиеся с тяжелым и классическим проявлением СМ, локализуются преимущественно в экзонах 24 и 27-32. Они предполагают, что фенотипические проявления СМ во многом могут зависеть от влияния эпигенетических факторов.

Всего в экзонах 24-32 описано 64 мутации, в то время как в экзонах 33-40 - всего 11 мутаций. Кластерное расположение мутаций в экзонах 24-32 является статистически достоверным (Р<0,001). Аналогично, при обследовании пробандов с ССА, все идентифицированные мутации обнаружены в экзонах 24-34 гена FBN2 [20]. Авторы статьи предполагают, что экзоны 24-32 (34) в FBN1 и FBN2 генах кодируют функционально важные регионы белков, и поэтому мутации в них приводят к выраженным фенотипическим изменениям. Мутации же, возникающие в других экзонах генов FBN1 и FBN2, могут не иметь клинических проявлений. Этим объясняют и малое количество мутаций, обнаруживаемых вне 24-32 экзонов.

Таблица 1. Характеристика пробандов с необычно тяжелым течением СМ

ДКА - дилятация корня аорты; ПМК - проляпс митрального клапана; Р - регургитация; ПД - панвальвулярная дисфункция; СН - сердечная недостаточность; ОЛ - оперативное лечение; ПрМК - протезирование митрального клапана; СЛА - стеноз легочной артерии; РАА - расслаивающая аневризма аорты; КС - контрактуры суставов; ВГК - воронкообразная грудная клетка; ПХ - подвывих хрусталиков; ДГК - деформация грудной клетки; ПТ - спонтанный пневмоторакс; ГС - гиперподвижность суставов; ВДС - выраженные деформации скелета; А - арахнодактилия; С - сколиоз; М - миопия; МГ - мышечная гипотония;

References

1. Pyeritz RE: The Marfan syndrome. Annu Rev Med 2000; 51:481-510.
2. De Paepe A, Devereux RB, Dietz HC, Hennekam RC, Pyeritz RE: Revised diagnostic criteria for the Marfan syndrome. Am ] Med Genet 1996; 62: 417-426.
3. Pereira L, D'Alessio M, Ramirez F et al: Genomic organization of the sequence coding for fibrillin, the defective gene product in Marfan syndrome. Hum Mol Genet 1993; 2(10): 1762.
4. Biery NJ, Eldadah ZA, Moore CS, Stetten G, Spencer F, Dietz HC. Revised genomic organization of FBN1 and significance for regulated gene expression. Genomics 1999; 56(1): 70-77.
5. Robinson PN, Godfrey M: The molecular genetics of Marfan syndrome and related microfibrillopathies. J Med Genet 2000,37(1):9-25.
6. Collod-Beroud G, Beroud C, Ades L et al: Marfan Database (third edition): new mutations and new routines for the software. Acids Res 1998; 26(1): 229-223.
7. Hayward C, Brock DJ: Fibrillin-1 mutations in Marfan syndrome and other type-1 fibrillinopathies. Hum Mutat 1997,10(6): 415-423.
8. Beighton P, de Paepe A, Danks D et al: International nosology of heritable disorders of connective tissue, Berlin, 1986. Am J Med Genet 1988; 29(3):581-594.
9. Booms P, Cisler J, Mathews KR et al: Novel exon skipping mutation in the fibrillin-1 gene: two 'hot spots' for the neonatal Marfan syndrome. Clin Genet 1999; 55(2): 110-117.
10. Palz M, Tiecke F, Booms P et al: Clustering of mutations associated with mild Marfan-like phenotypes in the 3' region of FBN1 suggests a potential genotype-phenotype correlation. Am J Med Genet 2000; 91(3):212-221.
11. Lerman LS, Silverstein K: Computational simulation of DNA melting and its application to denaturing gradient gel electrophoresis. Methods Enzymol 1987; 155: 482-501
12. Gille C, Gille A, Booms P, Robinson PN, Nurnberg P: Bipolar clamping improves the sensitivity of mutation detect by temperature gradient gel electrophoresis. Electrophoresis 1998,19(8-9):1347-1350.
13. Robinson PN, Boddrich A, Peters H et al: Two recurrent nonsense mutations and a 4 bp deletion in a quasi-symmetric element in exon 37 of the NF1 gene. Hum Genet. 1995; 96(1): 95-98.
14. Pereira L, Levran 0, Ramirez F et al: A molecular approach to the stratification of cardiovascular risk in families with Mrfan's syndrome [see comments]. N Engi J Med 1994; 331(3): 148-153
15. Mathews K, Wang M, Corbit CK, Godfrey M: Fibrillin mutations in the 'neonatal region'. Toward genotype/phenotype correlations in neonatal Marfan syndrome. Am J Hum Genet 1995, 57: abstract 1966.
16. Godfrey M, Raghunath M, Cisler J et al: Abnormal morphology of fibrillin microfils in fibroblast cultures from patients with tal Marfan syndrome. Am J Pathol 1995; 146(6): 1414-1421.
17. Nijbroek G, Sood S, Mclntosh I et al: Fifteen novel mutations causing Marfan syndrome detected by heteroduplex analysis of genomic amplicons. Am J Hum Genet 1995; 57(1):8-21
18. Yuan X, Downing AK, Knott V, Handford PA: Solution structure of the transforming growth factor beta-binding protein-like module domain associated with matrix fibrils. EMBO J 1997,16(22): 6659-6666.
19. Kettle S, Yuan X, Gmndy G, Knott V, Downing AK, Handford PA. Defective calcium binding to fibrillin-1: consequence N2144S change for fibrillin-1 structure and function. J Mol Biol,1999; 285(3):1277-1287.
20. Park ES, Putnam EA, Chitayat D, Child A, Milewicz DM. Clustering of FBN2 mutations in patients with congenital contractual arachnodactyly indicates an important role domains encoded by exons 24 through 34 during human development. Am J Med Genet 1998; 78(4): 350-355.
21. Kainulainen K, Karttunen L, Puhakka L, Sakai L, Peltonen L. Mutations in the fibrillin gene responsible for dominant lentis and neonatal Marfan syndrome. Nat Genet I994, 6(1):64-69.
22. Putnam EA, Cho M, Zinn AB, TowbinJA, Byers PH, Milewicz DM.Delineation of the Marfan phenotype associated with mutations in exons 23-32 of the FBN1 gene. Am J Med Genet 1996,62(3):233-242.
23. Lipscomb KJ, Clayton-Smith J, Harris R: Evolving phenotype of Marfan's syndrome. Arch Dis Child 1997; 76: 41-46.
24. Liu W, Qian C, Comeau K, Brenn T, Furthmayr H, Francke U:Mutant fibrillin-1 monomers lacking EGF-like domains disrupt microfibril assembly and cause severe Marfan syndrome. Hum Mol Genet 1996; 5:1581-1587.
25. Grau U, Klein HG, Detter C et al: A novel mutation in the neonatal region of the fibrillin (FBN) 1 gene associated with a classical phenotype of Marfan syndrome (MfS). Hum Mutat 1998; 12:137.
26. Karttunen L, Ukkonen T, Kainulainen K, Syvanen AC, Peltonen L: Two novel fibrillin-1 mutations resulting in premature termination codons but in different mutant transcript levels and clinical phenotypes. Hum Mutat 1998; Suppl: S34-37.
27. Ng DK, Chau KW, Black C, Thomas TMM, Mak KL, Boxer M:Neonatal Marfan syndrome: a case report. J Paediatr Child Health 1999; 35: 321-323.
28. Schrijver I, Liu W, Brenn T, Furthmayr H, Francke U: Cysteine substitutions in epidermal growth factor-like domains of fibrillin-1: distinct effects on biochemical and clinical phenotypes. Am f Hum Genet 1999; 65: 1007-1020.
29. Bresters D, Nikkels PG, Meijboom EJ, Hoorntje TM, Pals G, Beemer FA: Clinical, pathological and molecular genetic findings in a case of neonatal Marfan syndrome. Acta Paediatr 1999; 88: 98-101.
30. El-Aleem AA, Karck M, Haverich A, Schmidtke J, Arslan-Kirchner M: Identification of 9 novel FBN1 mutations in German patients with Marfan-Syndrome. Hum Mutat 1999; 14: 181.
31. Francke U, Berg MA, Tynan K et al: A Glyll27Ser mutation in an EGF-like domain of the fibrillin-1 gene is a risk factor for ascending aortic aneurysm and dissection. Am f Hum Genet 1995;56: 1287-1296.
32. Perez AB, Pereira LV, Brunoni D, Zatz M, Passos-Bueno MR:Identification of 8 new mutations in Brazilian families with Marfan syndrome. Mutations in brief no. 211. Online. Hum Mutat 1999; 13:84.
33. Montgomery RA, Geraghty MT, Bull E et al: Multiple molecular mechanisms underlying subdiagnostic variants of Marfan syndrome. Am f Hum Genet 1998; 63: 1703-1711.
34. Pepe G, Giusti B, Attanasio M et al: A major involvement of the cardiovascular system in patients affected by Marfan syndrome:novel mutations in fibrilin 1 gene. J Mol Cell Cardiol 1997; 29:1877-1884.
35. Rantamaki T, Kaitila I, Syvanen AC, Lukka M, Peltonen L:Recurrence of Marfan syndrome as a result of parental germ-line mosaicism for an FBN1 mutation. Am J Hum Genet 1999; 64:993-1001.
36. Weidenbach M, Brenner R, Rantamaki T, Redel DA: Acute mitral regurgitation due to chordal rupture in a patient with neonatal Marfan syndrome caused by a deletion in exon 29 of the FBN1 gene. Pediatr Cardiol 1999; 20: 383-385.
37. Gibson MA, Ellis SL, Ades LC, Haan E, Cleary EG: Preferential pre-mRNA utilisation of an upstream cryptic 5" splice site created by a single base deletion mutation in exon 37 of the FBN-1 gene. Eur J Biochem 1998; 256: 221-228.
38. McGrory J, Cole WG: Alternative splicing of exon 37 of FBN1 deletes part of an 'eight-cysteine' domain resulting in the Marfan syndrome. Clin Genet 1999; 55: 118-121.
39. Milewicz DM, Pyeritz RE, Crawford ES, Byers PH: Marfan syndrome: defective synthesis, secretion, and extracellular matrix formation of fibrillin by cultured dermal fibroblasts. J Clin Invest 1992; 89: 79-86.
40. Dietz HC, Cutting GR, Pyeritz RE et al: Marfan syndrome caused by a recurrent de novo missense mutation in the fibrillin gene. Nature 1991; 352: 337-339.
41. Dietz HC, Saraiva JM, Pyeritz RE, Cutting GR, Francomano CA: Clustering of fibrillin (FBN1) missense mutations in Marfan syndrome patients at cysteine residues in EGF-like domains. Hum Mutat 1992; 1: 366-374.

Референт Осипова Г.Р.